Что такое перекисное окисление. Методичка по БХ ОВ_ПОЛ. Перекисное окисление липидов в норме и патологии. Ферментативное звено антиоксидантной системы защиты. Окисление в пищевых продуктах — сенсорные и пищевые изменения

16.09.2024

Количественное определение малонового диальдегида в ткани печени.

ОБОРУДОВАНИЕ: баня, ФЭК.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Основан на определении малонового диальдегида (МДА) как показателя перекисного окисления липидов при инкубации гомогенатов тканей в присутствии кислорода. В присутствии прооксидантов МДА определяется по специфической цветной реакции в кислой среде с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

ХОД РАБОТЫ.

В трех центрифужных пробирках приготовить инкубационную смесь реактивов по следующей схеме:

Реактивы	1 пробирка “опытная”	2 пробирка “контроль”	3 пробирка “опытная” с добавлением про- оксидантов
Трис-буфер 0,15 М	3,4 мл	3,4 мл	1,4 мл
Сульфат железа FeSO 4	-	-	1 мл
Аскорбиновая кислота	-	-	1 мл
ТХУ 10% раствор с ЭДТА	-	1 мл	-
Гомогенат печени	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл

Все пробирки поместить в термостат при 37 о С на 15 минут. После инкубации остановить реакцию в 1 и 3 пробирках, добавляя в них по 1 мл ТХУ с ЭДТА, перемешать. Все пробирки центрифугировать в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно слить в чистые пробирки. Затем в другие чистые пробирки отобрать по 4 мл надосадочной жидкости, добавить по 2 мл свежеприготовленного раствора ТБК (тиобарбитуровая кислота) и поместить пробирки в кипящую баню на 15 минут. Пробирки охладить в холодной воде и определить оптическую плотность на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм) в кювете 10 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Активность ПОЛ выражается количеством микромолей МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената

, где

Х - количество МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената,

a - молярный коэффициент экстинкции для малонового диальдегида при реакции с ТБК, численно равный 0.156.

D оп и D конт - оптические плотности "опытной" и "контрольной" пробирок соответственно.

РАСЧЕТ И ВЫВОДЫ:

ЛАБОРАТОНАЯ РАБОТА №2

Количественное определение каталазы в крови.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

В основе количественного определения активности каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени. О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества перманганата калия. израсходованного на титрование перекиси водорода до и после действия каталазы.

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом называют количество мг перекиси водорода, которое разлагается под действием 1 мкл крови.

ХОД РАБОТЫ.

Работу проводят по следующей схеме:

Р е а к т и в ы	Стаканчик № 1 (опыт)	Стаканчик № 2 (контроль)
Кровь	1 мл	1 мл
Вода дистиллированная	7 мл	7 мл
Перекись водорода 1%	2 мл	-
Серная кислота 10%	-	5 мл
Стаканчики оставляют на 30 мин при комн. t°, изредка встряхивая Через 30 мин
Перекись водорода 1%	-	2 мл
Серная кислота 10 %	5 мл	-

Действие каталазы в кислой среде прекращается, т. к. этот фермент действует при рН=7,4. Поскольку в контрольную пробу серную кислоту приливали до добавления перекиси водорода, то в контроле все добавленное количество перекиси водорода остается нерасщепленным.

Содержимое каждого стаканчика необходимо титровать раствором перманганата калия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.

КЧ = (А - В) х 1,7 ,

А - кол-во 0,1 N раствора КМnО 4 , пошедшее на титрование контрольной пробы в мл.

В - кол-во 0,1N раствора КМnО 4 , пошедшее на титрование опытной пробы в мл.

1,7 - это коэффициент, показывающий, сколько мг Н 2 О 2 содержится в 1мл 0,1н. раствора Н 2 О 2 .

В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц у взрослых и 7,5 - 9,9 единиц у детей.

РАСЧЕТ И ВЫВОДЫ:

Самостоятельная работа: составление тестов и кроссворда по теме ПОЛ.
Тестовый контроль:

Тема: ПОЛ.

1. К активным формам кислорода относят:

1. ОН- - гидроксильный радикал;

2. супероксидный анион;

3. Н2О2 - пероксид водорода

4. все перечисленное

Отв.: 4
2. Образование активных форм кислорода происходит:

в процессе переноса электронов в митохондриальной дыхательной цепи;
в реакциях, которые катализируются оксидазами (образуется перекись водорода), в том числе в свободнорадикальных процессах, совершающихся в фагоцитах;
в реакциях микросомального окисления при обезвреживании веществ с участием цитохрома Р-450;
в реакциях самопроизвольного (неферментативного) окисления веществ (гемоглобина, ферредоксинов, адреналина и др.);
в биологических системах с наличием ионов металлов с переменной валентностью и, прежде всего, железа (свободных атомов, так называемых внегемовых);
верно все

Отв.: 6
3. Перечислите ряд причин вызывающих активацию ПОЛ в тканях:

снижение поступления в организм алиментарных антиоксидантов (АО), таких как: токоферол, аскорбат, биофлавоноиды и др.;
стресс различного генеза, в частности эмоциональный (под влиянием катехоламинов и кортикостероидов в кровь поступает избыток жирных кислот и кислород);
внешние химические прооксиданты (пестициды, лекарственные окислители, алкоголь, продукты смога и т.д.);
физические факторы (повышенный радиоактивный фон, ультрафиолетовое облучение, электромагнитное поле, ультразвук с интенсивностью выше 2 Вт/см);
избыточное и несбалансированное потребление жиров и углеводов на фоне недостаточного их расходования;
гипокинезия с низким уровнем биологического окисления ферментов, т.е. сниженный уровень восстановления пиридиннуклеотидов;
врожденные энзимопатии антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы);
падение с возрастом активности антиоксидантных ферментов.
верного ответа нет
верно все перечисленное

Отв.: 10
4. Антиоксиданты нужны для…, исключите неправильный ответ:

обновления липидного состава мембран;
синтеза эйкозаноидов
обезвреживания ксенобиотиков и токсичных продуктов метаболизма;
функционирования иммунной системы.
синтеза глюкогона

Отв.: 1,2,4,5
5. Оксидативный стресс приводит:

Повреждение ДНК, белков, липидов мембран.
Канцерогенез, нейродегенеративные болезни, атеросклероз, сахарный диабет, сердечно сосудистые заболевания , старение.

Отв.: 1,2
6. Этот витамин ингибирует свободнорадикальное окисление путём отдачи электрона, что приводит к инактивации радикала липида и превращается в стабильный, полностью окисленный токоферолхинон: Отв.: 3

7. Вит. A:

увеличивает антиоксидантное действие Вит. Е; Вместе с Вит. E и Вит. С;
активирует включение Se в состав глутатионпероксидазы;
препятствует окислению SH-групп белков и пептидов.
может быть прооксидантом
все верно

Отв. 5

Структура, какого витамина представлена ниже :

Отв.: 1

9. Этот витамин активирует ПОЛ так как является полиненасыщенным спиртом и легко окисляется кислородом может быть прооксидантом (в высоких дозах):

Отв.: 2
10. Процесс свободнорадикального перекисного окисления липидов можно условно разделить на три этапа. Перечислите их в правильной последовательности.

продукция перекисей липидов (перекисный этап);
образование свободных радикалов органических и неорганических веществ (свободнорадикальный этап);
кислородная инициация (кислородный этап

Отв.: 3,2,1
VIII Хронокарта учебного занятия:

Общий бюджет времени: 3 (125);
Перекличка 5 минут;
Разбор основных вопросов темы 60 минут;
Тестовый опрос 20 минут;
Проведение лабораторной работы;
Оформление протоколов 10 минут

IX Самостоятельная работа студентов:

Составление тестов и кроссвордов по данной теме.

X Список используемой литературы:

Обязательная:

1. Биохимия. Учебник для вузов / Под ред. Е.С.Северина. М.:Гэотар-мед, 2003. 784 с.

2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, Москва, 1998. 740 с.

3. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. Под ред. проф. Е.С.Северина и проф. А.Я.Николаева. М.: Гэотар-мед, 2001. 441 с.

4. Строев Е.А. Биологическая химия. Москва, 1986.

5. Дзугкоева Ф.С., Калоева Л.А., Каряева Э.А., Гурина А.Е., Баллаева С.А. «Обмен веществ (учебно-методическое пособие)» с грифом Учебно -методическое объединение МЗ РФ, Владикавказ, 2003. 170 с.

Дополнительная:

Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова, А.И. Деев с соавт. // Итоги науки и техники, 2000. – Т. 29. - С. 151-167.
Евстигнеева Р.П. Витамин Е как универсальный антиоксидант и стабилизатор биологических мембран / Р.П. Евстигнеева, И.М. Волков, В.В. Чудинова // Биол. Мембраны, 2003. - № 2. С. 119-137.
Зборовская В.А. Антиоксидантная система организма, ее значение в метаболизме / В.А. Зборовская, М.В. Банникова // Вестник РАМН, 2000. - № 6. - С. 53-63.
Зенков Н.К. Окислительный стресс / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньщикова. - М.: Наука, 2004. - 343с.
Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высш. школа, 1998. - 293с.
Соловьева А.Г. Активность альдегиддегидрогеназы в эритроцитах, тромбоцитах и плазме крови крыс в норме и при ожоге / А.Г. Соловьева // Успехи соврем. Естествознания, 2007. - № 12. – С. 12-15.
Суханова Т.А Патохимия клетки / Т.А. Суханова // Успехи соврем. биологии, 2004. – Т. 40. – С. 82-104.
Шепелев А.П. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А.П. Шепелев, И.В. Корниенко, А.В. Шестопалов с соавт. // Вопр. мед. Химии, 2004. - № 2. - С. 15-17.

Наглядные пособия

За несколько десятков лет, прошедших с момента появления концепции перекисного окисления липидов (ПОЛ), она так и не подтверждена практикой, являющейся критерием истинности науки. Возникает ряд вопросов, требующих ответа. Если этот феномен так важен, например для развития атеросклероза (как утверждают авторы), то почему антиоксиданты не предупреждают, не останавливают патологический процесс, а в то же время меры по снижению уровня холестерина в крови являются эффективными? В каких исследованиях in vivo подтверждены «лавинообразные», «цепные» разрушения клеточных мембран в процессе ПОЛ? Как могут существовать нормальные показатели продуктов ПОЛ в крови при хаотическом процессе? Возможны ли такие разрушительные не подконтрольные ДНК процессы в клетке, организме вообще? Почему распространенные представления о ПОЛ не соответствуют современным биохимическим требованиям для заключения о подлинности существования изучаемого метаболического процесса в организме? Нужно ли витамины Е, С, А (бета-каротин) именовать антиоксидантными? Ведь они имеют большое количество других не менее важных биологических функций, а их дефицит приводит к нарушениям различных видов обмена в организме. Эти факты, а также, что самое важное, - отсутствие эффекта от применения антиоксидантов при различных заболеваниях (например при атеросклерозе) и не редко возникновение антиэффекта, требуют переосмысления теории ПОЛ . Многие положения теории ПОЛ вступают в противоречие с фундаментальными законами биохимии. Возникает, в частности, вопрос, как выражена степень реакций ПОЛ в детском возрасте, когда преобладают анаболические процессы, или в среднем возрасте, в условиях практического равновесия анаболической и катаболической фаз метаболизма. Ответ на эти вопросы в литературе отсутствует. Для суждения о степени изменений ПОЛ клиницисты часто определяют в крови диеновые конъюгаты и малоновый диальдегид. При этом дают нормативы этих показателей, что противоречит самой концепции, поскольку существование нормальных параметров процесса свидетельствует о его генетической обусловленности, а не стихийности.

Реакции окисления происходят в клетке в соответствующих структурах: митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме (микросомальное окисление). В митохондриях в цепи переноса электронов возможно неполное восстановление кислорода и образование перекиси водорода, супероксидного радикала . Образование активных форм кислорода (АФК) в митохондриях, по мнению А. Ленинджера, является нормальным физиологическим явлением, что, однако, требует объяснения предназначения и биологической целесообразности этого процесса. (В фагоцитах «дыхательный взрыв» играет важную роль в обезвреживании бактерий и разрушении неинфекционного материала). Уменьшение движения потока электронов по окислительно-восстановительной цепи митохондрий приводит к уменьшению образования АФК. АФК постоянно производятся при взаимодействии кислорода с коферментами флавиновых ферментов. Они образуются в эндоплазматическом ретикулуме в коротких цепях переноса электронов. В цикле реакций микросомального окисления с участием цитохрома Р450 в качестве промежуточных продуктов возникают супероксидные радикалы и перекись водорода. Супероксид образуется и в других электронно-транспортных клеточных системах. Образование АФК происходит под действием ионизирующего и ультрафиолетового излучения, гипербарической оксигенации, токсических веществ . В пероксисомах продуцируется перекись водорода, которая эффективно обезвреживается. Перекись водорода может восстановиться супероксидом с образованием гидроксильного радикала. Гидроксильный радикал, взаимодействуя с супероксидом, может образовать синглетный кислород, хотя течение этой реакции in vivo не доказано . Считают , что синглетный кислород в обычных биологических условиях организма не играет существенной роли. Благодаря тому, что ферменты, образующие перекись водорода, и каталаза локализованы внутри пероксисом, остальное содержимое клетки защищено от разрушающего воздействия перекиси. Все АФК нестабильны и короткоживущие.

В соответствии с концепцией, образующиеся свободные радикалы инициируют так называемое ПОЛ - свободнорадикальное окисление ненасыщенных жирных кислот (НЖК) в биомембранах, приводящее к образованию гидроперекисей липидов. Следствием предполагаемых цепных реакций является возрастание продуктов ПОЛ, способных вызывать нарушение структуры различных биосубстратов и тем самым повреждать белки и липиды биомембран, инактивировать ферменты, изменять строение макромолекул, целостность клетки и внутриклеточных органелл. Таким образом, постулируется некая глобальная система окисления, возможная во всех клеточных образованиях, содержащих в своем составе НЖК, хаотический процесс, в основе которого лежат «цепные, лавинообразные» реакции. И в то же время приводятся нормы промежуточных продуктов ПОЛ - например малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, других продуктов. Возникает первое противоречие: внутриклеточный хаос, разрушительный процесс генетически запрограммирован, что противоречит биологическим законам. В качестве второго противоречия можно отметить, что ПОЛ как системное явление не соответствует требованиям, предъявляемым к изучению метаболических процессов (таблица).

Таблица. Стратегия изучения метаболического процесса или метаболического пути

↓	Вывод о существовании биохимического процесса или метаболического пути, сделанный на основании наблюдений над целым организмом
↓	in vivo
↓	Анализ нарушений процесса, вызванных специфическими болезнями (врожденные ошибки метаболизма, рак и т.д.)
↓	Локализация процесса в одном или нескольких органах
↓	Локализация процесса в одной или нескольких клеточных органеллах или субклеточных фракциях
↓	Рассмотрение процесса в виде отдельных реакций
↓	Очистка его индивидуальных субстратов, продуктов, ферментов, кофакторов и других компонентов
↓	Анализ механизмов, контролирующих процесс in vitro
↓	Изучение механизмов отдельных реакций
↓	Реконструкция процесса
↓	Изучение процесса на генетическом уровне методом рекомбинантных ДНК

Применение такого подхода позволяет обычно выяснить детали биохимических процессов или метаболических путей. В общем виде эта схема использовалась для изучения главных метаболических путей в организме. Организация метаболических процессов в организме контролируется генетической программой на всем протяжении жизни. Поэтому утверждение «хаоса» ПОЛ противоречит вышеназванному постулату.

Схема. Образование эйкозаноидов (по: Марри Р. и соавт., 2004)

Третье противоречие заключается в том, что в организме существует ферментная система, подконтрольная геному, осуществляющая синтез эйкозаноидов (простагландинов, лейкотриенов, тромбоксанов), играющих важнейшую роль в функционировании организма. В этом процессе промежуточными продуктами являются малоновый диальдегид, гидроперекиси липидов (схема). И здесь действительно речь может идти о нормативах этих и других показателей. Образование эйкозаноидов является элементом проявления общего неспецифического адаптационного синдрома. Поэтому увеличение количества различных продуктов ПОЛ (в том числе малонового диальдегида и диеновых конъюгатов) выявляют при большинстве заболеваний . Их уровень зависит от нейроэндокринных сдвигов как следствия развития неспецифического адаптационного синдрома. В стрессовой катаболической (адренергически-кортикоидной) фазе одновременно с распадом органических молекул протекают синтетические процессы - образуются эйкозаноиды, позволяющие преодолевать стресс. Перекиси липидов, образующиеся в процессе синтеза эйкозаноидов, полностью метаболизируются, нейтрализуются (а не накапливаются, как считают сторонники теории ПОЛ).

Из третьего противоречия вытекает четвертое: если интенсивный самопроизвольный процесс окисления НЖК (ПОЛ) происходит, то как определить, какая часть перекисных продуктов образуется в процессе ПОЛ, инициируемом АФК, а какая - в процессе синтеза эйкозаноидов? В настоящее время определяемые перекисные продукты сторонниками концепции приписываются ПОЛ при отсутствии каких-либо доказательных исследований.

В свете сказанного становится понятным отсутствие даже упоминания о ПОЛ в известном учебнике Д.М. Фаллера и Д. Шилдса «Молекулярная биология клетки» , монографии известных биохимиков Я. Кольмана и К.Г. Рема . В то же время детально представлены сведения об эйкозаноидах, их роли в функции клетки. Сама теория ПОЛ изначально базируется на результатах исследований in vitro . Возможность существования подобных разрушительных процессов in vivo вызывает большие сомнения, исходя из того, что период полужизни белков, интенсивность клеточного деления, апоптоз запрограммированы ДНК. Как показал с помощью изотопов Шёнхаймер, обмен липидов в организме протекает поразительно быстро. Очень быстрым процессом является обновление жирных кислот. Период биологической полужизни жирных кислот в различных органах животных составляет от 1,5 до 8 сут. На наш взгляд, ошибочным является утверждение, что перекиси липидов накапливаются в организме и оказывают токсическое действие. Известно, что образующиеся в процессе окисления НЖК гидроперекиси и циклические перекиси не могут накапливаться в организме: они разлагаются до жирных альдегидов, например: капронового, малонового, полуальдегида капроновой кислоты . Линолевая кислота образует 1 молекулу малонового диальдегида, линоленовая - 2, арахидоновая - 3, клупанодоновая - 4. Продукты расщепления линолевой кислоты подвергаются дальнейшему окислению с образованием капроновой, азелаиновой и малоновой кислот, которые в конечном итоге подвергаются окислению до СО 2 и Н 2 О 2 в цикле Кребса. Подобному превращению подвергаются промежуточные продукты линоленовой, арахидоновой и клупанодоновой кислот.

По заключению известного биохимика А. Ленинджера , в клетках человека в обычных условиях самоокисление НЖК полностью заторможено благодаря наличию витамина Е, различных ферментов и аскорбиновой кислоты. Исследования доказательного характера, которые бы опровергли эту точку зрения, до сих пор отсутствуют. А. Ленинджер допускает, что при некоторых заболеваниях самоокисление может иметь место, вызывая образование в ряде тканей аномальных липидных включений. Тот факт, что ПОЛ, инициируемое в гидрофобном пространстве клеточных мембран, способно прерываться витамином Е, подтверждают другие биохимики. Высокая концентрация витамина Е в биологических мембранах препятствует их повреждению свободными радикалами . Дефицит же витамина Е у человека отмечается чрезвычайно редко . Следует думать, что многочисленные публикации клинического характера, авторы которых определяли диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, гидроперекиси и другие метаболиты при самых различных заболеваниях и состояниях, отражают не ПОЛ, а другой конкретный ферментативный, генетически обусловленный процесс - синтез эйкозаноидов. В процессах синтеза эйкозаноидов участвует целый ряд ферментов (фосфолипаза А 2 , циклооксигеназы, липооксигеназы и др.). Из свободных полиненасыщенных жирных кислот и, прежде всего, арахидоновой (линолевой, линоленовой после их превращения в арахидоновую кислоту) образуются простагландины . Перечисленные полиненасыщенные жирные кислоты входят в состав фосфолипидов, в молекуле которых эфирной связью связаны с С-2-концом глицерола. Из фосфолипидов они высвобождаются под действием фосфолипазы А 2 и становятся субстратом биосинтеза простагландинов. Продукты окисления выводятся с мочой. В мембранах клеток различных тканей имеются рецепторы, на которые действуют простагландины. Иными словами, образование перекисей липидов в различных тканях является нормальным процессом и осуществляется под контролем ферментов. Все полиеновые кислоты (линолевая, линоленовая, арахидоновая) при участии липооксигеназы окисляются до гидроперекисей, гидроксипроизводных жирных кислот, из которых в результате последовательных реакций образуются лейкотриены . При участии простагландин-синтазы (циклооксигеназа + пероксидаза) арахидоновая кислота превращается в ее метаболиты - простагландины, простациклины, тромбоксаны, лейкотриены, то есть локальные гормоны, обладающие различной физиологической активностью . Поскольку образование эйкозаноидов является элементом общего неспецифического адаптационного синдрома, рост количества различных продуктов ПОЛ определяется при самых различных заболеваниях . Уровень продуктов ПОЛ зависит от нейроэндокринных сдвигов как следствия развития стресса.

Выводы

Имеющиеся на сегодняшний день представления о ПОЛ, в основном базирующиеся на исследованиях in vitro , не соответствуют требованиям, предъявляемым для признания существования изучаемого метаболического процесса или метаболического пути. Нет критериев, методологических подходов, позволяющих судить о параметрах выраженности ПОЛ in vivo . Оценивать выраженность ПОЛ (инициируемом АФК) в организме по содержанию в крови продуктов ПОЛ не представляется адекватным, поскольку эти метаболиты образуются в процессе биосинтеза эйкозаноидов - ферментативного, генетически детерминированного процесса. Тот факт, что в крови определяется физиологический (фоновый) уровень малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, других продуктов ПОЛ, свидетельствует о существовании строгого контроля за окислением липидов со стороны иерархической системы регуляции, и в конечном итоге ДНК. (ДНК осуществляет контроль метаболизма посредством синтеза ферментов и клеточных белков.) Поэтому утверждение о существовании в клетках неконтролируемых свободнорадикальных реакций в больших масштабах является необоснованным. По мнению А. Ленинджера, «…в клетках в обычных условиях самоокисление ненасыщенных жиров полностью заторможено благодаря наличию витамина Е, различных ферментов, а также, по-видимому, аскорбиновой кислоты. Однако при некоторых заболеваниях оно может иметь место, вызывая в ряде тканей образование аномальных липидных включений (Т. 1, с. 331)». Существенные повреждения свободными радикалами липидов клеточных мембран, нуклеиновых кислот происходят при лучевой болезни, влиянии канцерогенных, токсических факторов.

Список использованной литературы

1. Грацианский Н.А. (2002) Очередное (окончательное) подтверждение неэффективности антиоксидантных витаминов в профилактике коронарной болезни сердца и ее осложнений. Кардиология, 42(2): 85–86.
2. Грацианский Н.А. (2001) Статины как противовоспалительные средства. Кардиология, 12: 14–26.
3. Ленинджер А. (1985) Основы биохимии: В 3 т. Мир, Москва, Т. 1.
4. Хорст А. (1982) Молекулярные основы патогенеза болезней.: Пер. с польск. Медицина, Морсква, 456 с.
5. Stadtman E.R., Oliver C.N. (1991) Metal-catalyzed oxidation of proteins: physiological consequences. J. Biol. Chem., 266: 2005–2008.
6. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. (1981) Основы биохимии: В 3 т. Мир, Москва. Т. 2, 617 с.
7. Марри Р., Греннер Д., Мейес П. и др. (2004) Биохимия человека. Пер. с англ.: В 2 т. Мир, Москва. Т. 2, 414 с.
8. Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю. и др. (2004) Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия. МОРИОН, Киев, 160 с.
9. Фаллер Д.М., Шилдс Д. (2006) Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. Пер. с англ. Издательство БИНОМ, Москва, 256 с.
10. Кольман Я., Рем К.Г. (2000) Наглядная биохимия: Пер. с нем. Мир, Москва, 469 с.
11. Савицкий И.В. (1981) Биологическая химия. Вища школа, Київ, 488 с.
12. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. (1990) Биологическая химия: Учеб. под ред. С.С. Дебова, Медицина, Москва, 528 с.
13. Ерин А.Н., Скрыпин В.И., Прилипко Л.Л. (1988) Витамин Е. Молекулярные механизмы действия в биологических мембранах. Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига. С. 180–208.
14. Владимиров Ю.А. (1989) Роль нарушений липидного слоя мембран в развитии патологических процессов. Патолог. физиол. и эксперим. терапия. 4: 7–17.
15. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. (1989) Free radicals in biology and medicine. 2 nd ed. Clarendoln Press, Oxford.
16. Halliwell B., Gross C.E. Gutteridge J.M.C. (1992) Free radicals, antioxidants and human disease: where are we now? Lab. Clin. Med., 119: 598–620.

ПЕРЕКИСНЕ ОКИСнЕННЯ ЛІПІДІВ: ПРОТИРІЧЧЯ ПРОБЛЕМИ

В.К. Казимирко, Л.М. Іваніцька, В.В. Кутовий, А.Г. Дубкова, Т.С. Сілантьєва

Резюме. Уявлення про перекисне окиснення ліпідів (ПОЛ), що в основному базуються на дослідженнях in vitro, не відповідають вимогам, які ставляться для визнання існування метаболічного процесу чи метаболічного шляху. Відсутні критерії, методологічні підходи, які дозволяють визначити параметри вираженості ПОЛ in vivo. Наявність у крові фізіологічного (фонового) рівня малонового діальдегіду, дієнових кон’югатів, інших продуктів ПОЛ свідчить про існування чіткого контролю за окисненням ліпідів з боку ієрархічної системи регуляції та на завершення - ДНК. Тому твердження про існування у клітинах неконтрольованих вільнорадикальних реакцій у великих масштабах є необґрунтованим. При деяких захворюваннях самоокиснення може мати місце, викликаючи утворення в ряді тканин аномальних ліпідних включень.

Ключові слова: перекисне окиснення ліпідів, вільні радикали, ДНК, дієнові кон’югати, малоновий діальдегід, ейкозаноїди.

LIPID PEROXIDATION: CONTROVERSERY PROBLEM

V.K. Kazimirko, L.N. Ivanitska, V.V. Kutovyi, A.G. Dubkova, T.S. Silantieva

Summary. The concept of lipid peroxidation, mainly based on studies in vitro, does not meet the requirements for recognition of the studied process existence or metabolic pathway. There are no criteria, methodological approaches to judge the severity of lipid peroxidation parameters in vivo. Determined in blood physiological (background) level of malondialdehyde, conjugated diens and other lipid peroxidation products, indicates the existence of lipid oxidation strict control by the hierarchical system of regulation and eventually - DNA. Therefore, the assertion of the existence of cells uncontrolled free radical reactions on a large scale is unreasonable. In some diseases, auto-oxidation may occur, causing the formation of abnormal lipid inclusions in a number of tissues.

Key words: lipid peroxidation, free radicals, DNA, conjugated diens, malondialdehyde, eicosanoids.

Адрес для переписки:
Казимирко Виталий Казимирович
04112, Киев, ул. Дорогожицкая, 9
Национальная медицинская академия
последипломного образования
имени П.Л. Шупика

Федеральное агентство по образованию

ФГОУ ВПО Сибирский федеральный университет

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Кафедра биохимии и физиологии человека и животных

В.С. Выборова

студентка V курса

(дипломная работа)

Допустить к защите:

Зав. кафедрой, д.м.н., проф. А.А. Савченко

Научный руководитель:

Канд. биол. наук, проф.

Н.М. Титова

Красноярск 2008

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Активные формы кислорода – классификация и свойства

1.2. Перекисное окисление липидов

1.3. Антиоксидантная система

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

2.2. Определение содержания малонового диальдегида

2.3. Определение содержания диеновых коньюгатов

2.4. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты исследований и обсуждение

Список литературы

В последние годы широко обсуждается роль активных форм кислорода (АФК) и инициируемых ими свободнорадикальных процессов при различных патологических процессах, а так же при беременности. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, но при стрессовых ситуациях происходит усиленное образование АФК, под действием которых происходит избыточная и неконтролируемая активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что в конечном итоге может привести к патологическому состоянию, которое сопровождается дисбалансом ферментативных и неферментативных компонентов системы антиоксидантной защиты. Физиологическая беременность может сопровождаться существенными изменениями в про/антиоксидантном статусе.

Характерным проявлением окислительного стресса является интенсификация процессов перекисного окисления липидов, индикатором которой служит увеличение содержания хотя бы одного из его продуктов. Данные о содержании продуктов ПОЛ в биологических объектах могут нести в себе информацию о глубине и степени патологического процесса. В качестве количественных маркеров наиболее часто используются такие интермедиаты ПОЛ, как диеновые конъюгаты (ДК), а также один из его конечных продуктов – малоновый диальдегид (МДА).

Цель данной работы – определение содержания ДК и МДА в плазме крови у женщин в разные периоды беременности.

В задачи работы входило:

1. Определить содержание продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови небеременных женщин.

2. Определить содержание ДК в плазме крови женщин в динамике беременности.

3. Определить содержания МДА в плазме крови женщин в динамике беременности.

Работа выполнена на базе кафедры биохимии и физиологии человека и животных Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского Федерального университета и Хакасского республиканского центра планирования семьи.

Глава 1. Обзор литературы .

Термин активные формы кислорода (АФК) объединяет целый ряд образующихся в организме промежуточных и побочных продуктов восстановления молекул кислорода, таких как супероксидный (О2-), гидроксильный (НО·), пергидроксильный (НО2∙), пероксильный (RO2∙) и алкоксильный (RO∙) радикалы, оксид азота (NO∙), пероксинитрит (ONOO-), гипохлорит (HOCl), перекись водорода (H2O2) и др. Помимо продуктов восстановления О2, к АФК относят также озон (О3) и синглетный кислород 1О2, то есть кислород, находящийся в возбужденном (синглетном) состоянии [Владимиров, 1998; Осипов, Азизова, Владимиров, 2003]. Все АФК, кроме синглетного кислорода, представляют собой разные химические соединения: молекулы (Н2О2), свободные радикалы (ОН, НО2), ион-радикалы (О2-). Поэтому термин активные формы кислорода следует считать собирательным, он подчеркивает высокую реакционную способность промежуточных продуктов восстановления молекулы кислорода, кислородных радикалов и их прекурсоров.

Радикалы кислорода образуются в ходе процессов, связанных с транспортом электронов по дыхательной цепи. В обычных условиях на генерацию АФК расходуется от 1 до 5% потребляемого кислорода. Однако эта величина может существенно возрастать при изменении кислородного бюджета организма – при гипероксии или гипоксии. В результате последовательного восстановления молекулярного кислорода происходит образование супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала.

Супероксидный анион-радикал (О2-). Среди кислородных свободных радикалов ему отводят наиболее значительную роль, так как считается, что именно он является родоначальником многих других активных форм кислорода. Супероксидный радикал (СОР) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии . Химическая активность О2- в значительной степени зависит от физико-химического состояния окружающей его клеточной или внеклеточной среды. В водных растворах О2- способен окислять аскорбиновую кислоту, адреналин и тиоловые соединения, выступая как слабый окислитель [Хавинсон, Баринов, Арутюнян 2003]. Значительно более выражены восстановительные свойства супероксидного радикала. В присутствии ионов негемового железа СОР достаточно активно восстанавливает его из трехвалентного в двухвалентное состояние. Это свойство СОР чрезвычайно важно, поскольку двухвалентное железо играет большую роль в образовании агрессивных липидных и гидроксильных радикалов [Владимиров, 1998]. Супероксидный радикал также может восстанавливать содержащие трехвалентное железо комплексы (цитохром с, ферри-ЭДТА) и нитросиний тетразолий .

Образование супероксида в организме в основном происходит при работе митохондриальной и микросомальной цепей переноса электронов, в результате «утечки» электронов с восстановленных элементов этих цепей на молекулярный кислород [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003], при активации фагоцитирующих клеток крови и тканевых макрофагов [Владимиров, 1998], в ходе энзиматических реакций при действии, так называемых «перекись продуцирующих ферментов», моно-и диаминооксидаз, моно-и диоксигеназ, при окислении гемоглобина и миоглобина, а также любых, склонных к аутоокислению биомолекул: аскорбиновой кислоты, восстановленного глутатиона, биогенных аминов [Хавинсон, Баринов, Арутюнян, 2003].

Для регуляции уровня О2- в клетках служит высокоспецифичный фермент-антиоксидант – супероксиддисмутаза (СОД), которая обладает существенной способностью ускорять реакции дисмутации радикала с образованием молекул перекиси водорода и кислорода.

О2- + О2- + 2Н+ → Н2О2 + О2

Пероксид водорода. Н2О2 не является свободным радикалом. Образование О2- в любой биологической модельной системе сопровождается накоплением Н2О2, образующимся в результате дисмутации (неферментативно или в присутствии супероксиддисмутазы) [Дубина, 2004]. Поэтому в организме повышение концентрации Н2О2 наблюдается при активации процессов, которые связаны с генерацией супероксидного радикала: при состояниях метаболического взрыва фагоцитирующих клеток; при усиленной деятельности митохондриальных и микросомальных электронтранспортных цепей; при повышении активности оксидазных ферментов.

Будучи стабильным продуктом восстановления кислорода, Н2О2 обладает свойствами слабого окислителя. Эти свойства проявляются, в частности, в присутствии ионов металлов с переменной валентностью в восстановленной форме [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003], в результате чего образуется высокоактивный гидроксильный радикал:

Н2О2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + OH

В отсутствии каталазы и ионов металлов переменной валентности пероксид водорода довольно стабилен и вследствие своей незаряженной ковалентной структуры воспринимается клеткой, как молекула воды. Благодаря этому Н2О2 может легко проникать в клетки и ткани, при этом наличие нейтральных аддуктов пероксида водорода (например, гистидина) обеспечивает проникновение внутрь клеток даже в присутствии каталазы. Считается, что биологическая активность Н2О2 существенно зависит от её концентрации. Так, при низких (микромолярных) уровнях Н2О2 является относительно слабореактивной. Однако с ростом концентрации агрессивность пероксида водорода увеличивается и при достаточно высоком (миллимолярном) уровне Н2О2 обладает цитотоксическим действием и может вызывать гибель фибробластов и других типов клеток, включая гепатоциты и эндотелиальные клетки. В сублетальных концентрациях пероксид водорода существенно изменяет статус эндотелиальных клеток, что проявляется в ингибировании транспорта анионов через мембрану, увеличении внутриклеточной концентрации Са2+, активации фосфолипаз и фосфоинозитидного обмена, повреждает Сu,Zn-СОД, тем самым снижая антиоксидантную защиту клеток [Меньщикова с соавт., 2006].

Клетки млекопитающих достаточно устойчивы к воздействию пероксида водорода, благодаря наличию глутатионпероксидазной и каталазной ферментативных систем, первая из которых эффективно работает при малых концентрациях перекиси, вторая – при высоких.

Гидроксильный радикал (НО∙). Одноэлектронное восстановление Н2О2 приводит к образованию гидроксильных радикалов, обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью. Разложение Н2О2 в присутствии ионов двухвалентного железа является основным путем образования НО∙ (реакция Фентона) [Владимиров, Арчаков, 2003]:

H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + HO∙

Другой путь образования гидроксильного радикала – это реакция разложения гипохлорита, которая также протекает с участием Fe2+ [Осипов, Якутова, Владимиров 2003; Якутова с соавт., 2004]:

НОCl + Fe2+ → HO + Cl- + Fe3+

Установлено, что образование гидроксильного радикала возможно при разложении гипохлорита также и железонезависимым путем

HOCl +O2- → HO + Cl- + O2-

Вследствие высокой химической активности время жизни ОН-радикалов в клетке составляет около 10-9 с, а расстояние, которое они успевают пройти за это время от места их образования, не превышает 100 нм. Таким образом, клеточная топография повреждающего действия ∙ОН-радикалов и, как следствие этого, характер эффекта повреждения будет зависеть от места их образования. Например, возникновение ОН-радикалов вблизи молекулы ДНК с высокой вероятностью приведет к модификации основания и взрыву одной из цепей ДНК .

Обладая наиболее высоким в живой природе редокс-потенциалом (Е0=+2.7В), и будучи вследствие этого чрезвычайно агрессивным, ∙ОН оказывает действие практически на любую биологическую молекулу. Но наибольший ущерб клетке наносят его реакции с ДНК, белками и полиненасыщенными жирными кислотами внутриклеточных и плазматических мембран, что определяет сильнейшее мутагенное и цитотоксическое действие гидроксильного радикала .

Важно отметить, что в организме нет специальных ферментативных систем, обладающих способностью инактивировать гидроксильный радикал. Низкомолекулярные соединения, такие как урацил, мочевая кислота, салицилаты, глюкоза, диметилсульфоксид, обладают способностью ингибировать ∙ОН-радикал только при достаточно высоких концентрациях [Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2004]. Таким образом, при целом ряде патологических состояний, сопровождающихся избыточным образованием АФК и, соответственно, гидроксильного радикала, организм становится практически беззащитным перед повреждающим действием этого соединения. Предотвращение повреждений клеточных структур осуществляется только за счет снижения концентрации радикалов предшественников ОН, в частности, супероксиданион-радикала и пероксида водорода.

Синглетный кислород (1О2). Образуется при изменении спина одного из электронов π-орбитали в молекуле кислорода. Источником синглетного кислорода являются реакции фотосенсибилизированного окисления биологических субстратов [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003]. При нефотохимических реакциях образование 1О2 возможно в результате неферментативной дисмутации супероксидных радикалов, протекающей с образованием перекиси водорода в присутствии ионов металлов с переменной валентностью:

О2- + О2- + Н2 → Н2О2 + 1О2

А также при взаимодействии некоторых сильных окислителей, например гипохлорита с Н2О2 и ферментативно – в реакциях восстановления цитохрома с . В отличие от молекулы О2, синглетный кислород обладает высокой химической активностью, особенно по отношению к молекулам, содержащим участки повышенной электронной плотности (ненасыщенные жирные кислоты, ароматические аминокислоты, основания). Типичным для 1О2 являются реакции взаимодействия с двойной связью. Это свойство 1О2 особенно важно для инициирования перекисного окисления ненасыщенных липидов в биологических мембранах [Меньщикова с соавт., 2006]. Кроме того, синглетный кислород, как и гидроксильный радикал, вызывает окисления сульфгидрильных групп в белках, декарбоксилирует аминокислоты, расщепляет нуклеиновые кислоты . Энергичное образование 1О2 в клетке может приводить к её повреждению или даже к гибели [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003].

Одним из наиболее эффективных гасителей синглетного кислорода в клетке является β-каротин, одна молекула которого способна потушить около 1000 его молекул прежде, чем он подвергнется окислительной деструкции [Владимиров, Арчаков, 2003].

Гипохлорит (НОСl). Хлорноватистая кислота – сильнейший окислитель, образуется в нейтрофилах при участии гем-содержащего цитоплазматического фермента миелопероксидазы . Миелопероксидаза окисляет ионы солей хлористоводородной кислоты, Сl- в присутствии Н2О2 в ходе реакции:

Н2О2 + Сl- + Н+ → НОСl + Н2О

НОСl не является свободным радикалом, но выступает как один из наиболее сильных окислителей.

НОСl атакует простейшие амины, сульфгидрильные группы в белках и хлорированные пуриновые основания в ДНК [Хавинсон c соавт., 2003]. НОСl может взаимодействовать с замещенными арил-аминами (например, с анилином, 1-нафтиламином и 1-нафтолом) даже при физиологических уровнях, образуя долгоживущие продукты, которые связываются с ДНК и являются генотоксичнымим для клеток человека [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003].

1.2. Перекисное окисление липидов .

Одним из важнейших следствий избыточного образования АФК является избыточная в этих условиях активация процессов ПОЛ [Барабой, 1991]. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, обеспечивающим протекание ряда физиологических процессов. Чрезмерная, патологически усиленная активация процессов ПОЛ под действием АФК приводит к необратимому изменению или повреждению мембранных структур, нарушению их проницаемости для ионов. Процессы ПОЛ можно условно подразделить на 3 последовательных этапа, или фазы развития: процесс зарождения цепей, процессы развития цепных реакций и обрыв цепей [Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2004].

В биологических мембранах окислению подвергаются преимущественно полиненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав фосфолипидов . На стадии инициирования под действием свободных радикалов О2, ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических веществ, относящихся к прооксидантам, происходит отрыв атома водорода в альфа-положении по отношению к двойной связи. Присутствие двойной связи в жирной кислоте (ЖК) ослабляет связь С-Н в смежных углеродных атомах и тем самым облегчает отщепление Н∙. Чем длиннее ненасыщенная боковая цепь кислоты жирного ряда, тем сильнее у неё склонность подвергнуться липидному окислению [Хавинсон, Баринов, Арутюнян, 2003]. Радикал с углеродом в центре претерпевает молекулярную перегруппировку с образование диена, содержащего сопряженные двойные связи, который в дальнейшем соединяется с О2 и образует радикал пероксида, способный отделить атом водорода от другой ЖК. Возникновение в результате этой реакции органических перекисей и нового радикала способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер [Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2004].

Таким образом, перекисное окисление липидов представляет собой процесс, связанный с активацией кислорода, особенность которого заключается в том, что молекула О2 присоединяется к свободному радикалу :

О2 + L∙ → LO2

В результате получается новый пероксильный радикал органического соединения. В дальнейшем происходит взаимодействие этого радикала с новой молекулой органического соединения, в результате чего протекает процесс цепного ПОЛ.

LO2∙ + LH → LOOH + L

L∙ + O2 → LO2∙

Реакции перекисного окисления липидов указаны на рис. 1.

Рис.1. Реакции перекисного окисления липидов [Владимиров, 1998]

Считается, что образование перекисей липидов осуществляется двумя путями: неферментативным – аскорбатзависимым (аскорбиновая кислота регенерирует ионы за счет обратного восстановления Fe3+ до Fe2+), активируемым металлами с переменной валентностью, и ферментативным (НАДФН-зависимым). По первому пути образование перекисей липидов происходит во всех мембранных структурах, а по второму – преимущественно в эндоплазматическом ретикуломе .

Ферментативное ПОЛ относится только к генерации липидных перекисей в активном центре фермента. Образованные при этом гидроперекиси и эндоперекиси являются стереоспецифическими и имеют важные биологические функции. В частности, это относится к циклооксигеназе и липооксигеназе.

Особенность неферментативного цепного окисления в биологических мембранах заключается в том, что оно практически не происходит в отсутствие металлов с переменной валентностью, в частности ионов двухвалентного железа [Владимиров, Арчаков, 2003]. Резко выраженное прооксидантное действие Fe2+ на ненасыщенные жирные кислоты (НЖК) в биологических мембранах обусловлено разложением продуктов реакции гидроперекисей, в результате которого в системе появляются новые свободные радикалы, инициирующие новые цепи окисления:

Fe2+ + LOOH → Fe3+ + OH + LO

При этом радикал LO вступает в дальнейшие реакции цепного окисления:

LO + LH → LOH + L

В последние годы появилось много данных, свидетельствующих, что ионы железа активируют процессы перекисного окисления также за счет того, что они участвуют в образовании гидроксильного радикала [Владимиров, 1998].

В ходе ПОЛ субстрат (полиненасыщенные ЖК) продолжают расходоваться, если только в этот процесс не вмешивается глутатионпероксидаза, восстановленный глутатион, витамин Е или другой антиоксидант , что ведет к прерыванию цепной реакции. Благодаря наличию в организме антирадикальной защиты, процессы пероксидации ограничиваются [Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2004]. Физиологическая роль перекисного окисления заключается в участии в процессах самообновления, самоперестройки биологических мембран, ионного транспорта, регуляции активности мембраносвязанных ферментов и других физиологических реакций . При интенсивном воздействии на организм химических или физических факторов процессы ПОЛ многократно усиливаются, образование АФК возрастает, а когда происходит срыв механизмов антирадикальной защиты, развивается окислительный стресс, который может проявляться на клеточном, тканевом и организменном уровнях. При этом усиление перекисного окисления липидов, чрезмерная продукция органических перекисей приводят к развитию патологических процессов [Суханова, 2004; Барабой с соавт., 2004].

Повышение уровня ПОЛ наблюдается при многих заболеваниях, различных патологических состояниях и интоксикациях. При этом считают, что в случае болезни и интоксикации происходит возрастание ПОЛ, продукты которого и являются ответственными за повреждение клеток и тканей. Однако, как было установлено , поврежденные ткани подвержены перекисному окислению липидов в гораздо большей степени, чем здоровые. Причина этого явления – инактивация некоторых биоантиоксидантов, утечка антиоксидантов из поврежденных клеток и выделение ионов металлов (особенно железа и меди) из мест их накопления в клетках и из металлопротеинов, гидролизованных освободившимися из разрушенных липосом ферментами [Воскресенский, Левицкий, 2003].

Состав продуктов перекисного окисления липидов достаточно сложен. К продуктам цепной реакции ПОЛ, прежде всего, относятся разновидности гидроперекисей, которые способны подвергаться нерадикальным окислительным превращениям, что приводит к образованию первичных (диеновые коьюгаты), и конечных продуктов ПОЛ (малоновый диальдегид, основания шиффа) [Журавлева с соавт., 2003].

Избыточное образование продуктов пероксидации приводит к целому комплексу цитотоксических эффектов, включающих инактивацию ряда ферментных систем, угнетение синтеза белка, повреждение и угнетение синтеза ДНК, лизис клеточных структур, нарушение репродуктивных процессов деления клеток.

Рис.2. Радикальные и нерадикальные продукты ПОЛ

Особенно важно подчеркнуть, что происходит нарушение мембранных структур, изменение транспорта ионов Са2+, создающее угрозу жизни клетки .

Образование АФК, известных как прооксиданты, наблюдается во многих метаболических процессах и является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток, а так же организма в целом, в кислородсодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, основу которых составляют ферментативные и неферментативные антиоксиданты [Петрович, Гуткин, 2005]. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбои этой непрерывности сопровождаются накоплением окислительных повреждений и приводят к возникновению окислительного стресса [Меньщикова с соавт., 2006].

Основными функциями антиоксидантной системы являются: ограничение интенсивности реакции свободнорадикального и перекисного окисления; защита чувствительных к окислительным повреждениям биомолекул мембран, внутри - и внеклеточных структур от действия свободных радикалов и перекисных соединений; восстановление окислительных молекулярных повреждений [Шепелев с соавт., 2004]. В целом основная задача системы антиоксидантной защиты состоит в предотвращении и ограничении развития патологических состояний, вызываемых окислительными повреждениями структур организма [Владимиров, 1998; Журавлев, 2003].

Общепринятой номенклатуры антиоксидантов в настоящее время нет. По химической природе биоантиокислители представляют собой широкий класс соединений: ферменты (СОД, каталаза, глутатионпероксидаза (ГПО)), фенолы и полифенолы (токоферолы, эвгенол), флавоноиды (рутин, кверцетин), стероидные гормоны и многие другие соединения [Бурлакова, Храпова, 2004]. В зависимости от растворимости различают жирорастворимые (витамин Е, А, К, убихинон) и водорастворимые (витамин С, SH-содержащие соединения) биоантиокислители, по молекулярной массе выделяют группу низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, α-токоферол, мочевая кислота) и высокомолекулярных (ферритин, каталаза) [Кения, Лукаш, Гуськов, 1993].

К числу энзимных антиоксидантов относят прежде всего супероксидредуктазу (СОР), восстанавливающую О2- в пероксид водорода, СОД, катализирующую реакцию дисмутации О2- с образованием пероксида водорода и молекулярного кислорода , каталазу, восстанавливающую Н2О2, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы (ГТ) .

Рис.3. Антиоксиданты водной фазы [Владимиров, 1998]

Главной ферментативной системой плазмы крови является ГПО внеклеточных жидкостей и ГПО гидроперекисей липидов (ГПО 4), которая будучи липофильным соединением эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфотидилхолина, холестерина и эфиров холестерина в липопротеинах низкой плотности (ЛПНП), восстанавливая их, следовательно, защищая от окислительной модификации . Кроме того ГПО 4 совместно с токоферолом практически полностью подавляет ПОЛ в биологических мембранах благодаря тому, что витамин Е эффективно восстанавливает пероксирадикалы, а фермент разлагает гидроперекиси, препятствуя тем самым их вовлечению в окислительный цикл .

Вместе с тем во всех водных и липидных фазах организма могут протекать радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют антиоксиданты-ингибиторы органических радикалов, среди которых важное место занимают соединения фенольного типа. В настоящее время выделено несколько тысяч фенольных соединений, среди которых выраженным антиоксидантным эффектом обладают витамины Е и К, убихиноны, триптофан и фенилаланин, а так же большинство растительных (флавоноиды) и животных пигментов [Дубина, 2005].

В антирадикальной защите липопротеинов плазмы крови и клеточных мембран α-токоферолу принадлежит ведущая роль – одна его молекула защищает ≈10000 молекул ненасыщенных жирных кислот [Евстигнеева, Волков, Чудинова, 2003], при этом считается, что α-токоферол способен обезвредить не менее 60% образующихся пероксильных радикалов [Тиунов, 1995]. Окисление α-токоферола со свободными радикалами компенсируется биорегенерацией молекул этого антиоксиданта в реакциях восстановления коантиоксидантами (АН), редокс-потенциал которых ниже, чем у радикала α-токоферола (α-Тф-О.) [Бурлакова, Крашков, Храпова, 1998]. В результате такой реакции не только происходит восстановление витамина Е, но и предотвращается возможность инициации α-токофероксильным радикалом окисления липидов:

α-Тф-О. + RH→ α-Тф-ОH + R. (1)

α-Тф-О. + АH→ α-Тф-ОH + А. (2)

Рис.4. Окислительно-восстановителные превращения α-токоферола и сопряженных с ним коантиоксидантов [Меньщикова с соавт., 2006].

Необходимо отметить наличие антирадикальных свойств у белков, хелатирующих ионы железа и других металлов с переменой валентностью. В первую очередь это трансферрин, лактоферрин и церулоплазмин. Основная роль трансферрина и близкого ему по структуре лактоферрина, содержащегося в молоке и выделяющегося фагоцитами при их активации, состоит в акцептировании «свободного» железа, что препятствует образованию радикалов НО.в реакциях Фентона, катализируемых ионами Fe [Зборовская, Банникова, 2000].Значимую роль в этом процессе играет церулоплазмин, Cu-содержащий белок, обеспечивающий окисление Fe 2+ до Fe3+ и делающий тем самым железо доступным для связывания трансферрина [Воскресенский с соавт., 2004; Krsek-Staples, Wbster, 2004; Василец, 2004]

Объектом исследования явилась замороженная плазма крови относительно здоровых небеременных и беременных женщин, поставляемая из Хакасского республиканского центра планирования семьи. Плазма хранилась при температуре -20° С до определения концентрации диеновых коньюгатов и малонового диальдегида. Всего было обследовано 127 женщин, деление на группы приведено в таблице 1.

Таблица 1

Группы обследованных женщин

В липидных системах в результате процессов ПОЛ образуется МДА, взаимодействие которого с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) приводит к образованию хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм. [Стальная, 1997].

Реактивы:

1. 30%-ная трихлоруксусная кислота (ТХУ);

2. 0,1 М этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА);

3. 1%-ная тиобарбитуровая кислота;

4. 0,05 н раствор NaOH;

5. Физиологический раствор.

Ход определения:

К 0,2 мл образца добавляли 0,8 мл физиологического раствора и 0,5 мл ТХУ. Перемешивали, оставляли стоять на льду 2 часа. Затем центрифугировали 15 мин. при 3000 об/мин. 1 мл супернатанта переносили в другую пробирку, добавляли 0,075 мл 0,1 М ЭДТА и 1%-ного ТБК, растворенной в 0,05 Н растворе NaOH. Содержимое перемешивали и ставили в кипящую водяную баню на 15 минут. Затем пробирки охлаждали при комнатной температуре и измеряли поглощение при длинах волн 532нм, а затем при 600 нм.

Расчет МДА производят по формуле:

C= _________________ x f,

C – концентрация МДА, мкмоль/л плазмы (эритроцитов),

D600 – оптическая плотность при длине волны 600 нм;

E – коэффициент экстинции 1,56x105М-1см-1;

f – коэффициент разведения. (f=9,94)

Вследствие π-π переходов спектры конъюгированных гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот характеризуются интенсивным поглощением в ультрафиолетовой области спектра с максимумом при 232-234 нм.

Определение содержания ДК проводили в экстрактах эритроцитов. Для этого липиды из эритроцитов экстрагировали стократным избытком смеси растворителей (гептан-изопропанольная смесь в соотношении 1:1). В гомогенизатор вносили 0,1 мл. упакованных эритроцитов, добавляли 5 мл. изопропилового спирта и тщательно растирали до получения гомогенной суспензии. Содержимое гомогенизатора количественно переносили в мерную центрифужную пробирку, в которую затем добавляли 5 мл. гептана.

Экстракт центрифугировали в течение 10 минут при 1700g. Надосадочную фракцию переносили в градуированную пробирку и добавляли 1/5 объема 0,74%-ного водного раствора KCI для отмывки липидного экстракта от нелипидных примесей. После тщательного встряхивания образовавшаяся эмульсия расслаивалась на две прозрачные фазы. В гептановом экстракте (верхняя фаза) измеряли спектрофотометрически содержание сопряженных диенов в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против гептана. Расчет количества ДК производили, используя молярный коэффициент экстинкции при длине волны 233 нм, равный 27000 М¯¹*см¯¹ [Паранич и соавт., 1993] и выражали в ммолях на мл клеток.

Д – оптическая плотность;

К – коэффициент ммолярной экстинкции = 21,0 мМ-1 см-1;

Статистическую обработку результатов осуществляли общепринятыми методами с использованием пакета прикладных программ Statistica 7.0. Достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни, с достоверностью Р<0,05 [Лакин, 1980].

Говоря об общей опасности воздействия свободных радикалов на организм, нельзя обойти эту проблему и у беременных женщин, от здоровья которых зависит будущее целого поколении детей.

При неосложненной беременности в организме женщин происходит целый ряд адапционно-приспособительных процессов, направленных на обеспечение адекватного течения гестационного периода, роста и развития плода. Известно, что важными составляющими адаптивных перестроек являются показатели агрегатного состояния крови, иммунного статуса, эндокринной системы а так же перекисного окисления липидов. В их сбалансированном взаимодействии в ответ на регулирующее влияние гипоталамуса заложено качество адаптации организма [Гусак, 2006].

Физиологическая беременность может сопровождаться существенными изменениями в про/антиоксидантном статусе. Одними из параметров, которые позволяют оценить состояние свободнорадикальных процессов является диеновые коньюгаты и малоновый диальдигид. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, но при стрессовых ситуациях происходит усиленная активация процессов ПОЛ под действием АФК, что приводит к патологическому состоянию.

В данной работе было определено содержание диеновых коньюгатов и малонового диальдегида у небеременных женщин (N=31), которые составили группу контроля. Согласно литературным данным содержание продуктов ПОЛ в частности МДА, являющегося одним из конечных продуктов данного процесса, с возрастом неуклонно возрастает [Банкова, Никанорова, 1988]. В группе небеременных женщин возраст значительно варьировал: от 18 до 39 лет. В связи с этим, мы разделили женщин контрольной группы по возрастному критерию на две подгруппы: в первую подгруппу вошли женщины в возрасте 18-28 лет (N=18), во вторую – 29-39 лет (N=13).

Содержание ДК и МДА в этих подгруппах приведены на рисунках 5 и 6.

В возрастной подгруппе от 18 до 28 лет содержание ДК составило 0,28 ммоль/л, а в возрастной подгруппе от 29 до 39 лет концентрация увеличилась на 28%. Та же закономерность выявлена и в содержании МДА.

Концентрация МДА в первой подгруппе составила 0,85мкмоль/л, во второй подгруппе уровень МДА повысился на 31%.

Наблюдаемые изменения свидетельствуют о том, что с возрастом на фоне усиления процессов ПОЛ происходит угнетение антиоксидантной системы. Нарушения в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности являются одним из механизмов формирования антиоксидантной недостаточности вследствие чрезмерного усиления ПОЛ.

В результате активации ПОЛ и накопления свободных радикалов происходит окислительная модификация липопротеинов плазмы крови, нарушение структурно-функциональной целостности клеточных мембран, освобождение лизосомальных ферментов, что в конечном итоге приводит к патологическим процессам в клетке и организме в целом.

При анализе содержания ДК и МДА между двумя возрастными подгруппами достоверных отличий не выявлено. Вследствие чего при сравнительном анализе содержания продуктов ПОЛ у беременных и небеременных женщин будут использованы данные по общей контрольной группе. Результаты исследования содержания ДК и МДА в общей контрольной группе приведены на рисунке 7.

Уровень ДК в контрольной группе женщин составил 0,35 ммоль/л, а МДА – 0,96 мкмоль/л. Наши данные по содержанию МДА в плазме крови согласуются с приведенными в литературе [Гусак, 2006]. Данных по содержанию ДК в плазме крови у относительно здоровых женщин мы в доступной литературе не встретили.

Анализ полученных результатов показал, что уровень ДК, являющихся первичными продуктами ПОЛ, существенно превышает таковой для конечного продукта – МДА.

Согласно данным литературы, у женщин показатели перекисного окисления липидов, а так же антиоксидантной системы изменяются в динамике репродуктивного цикла (1, 7, 14, 21 дни) [Гусак, 2006]. В первые дни менструального цикла происходит увеличение соотношения адреналин/серотонин, что свидетельствует о преобладании в функциональной активности гипоталамуса адренергических компонентов. Это приводит к депрессии противосвертывающей и антиокислительной систем крови, а так же активации клеточного и гуморального иммунитета, повышению неспецифической иммунной резистентности. Что проявляется увеличением концентрации диеновых коньюгатов и малонового диальдегида, активацией свертывающего потенциала крови.

К 21 дню цикла активность АОС прогрессивно увеличивается, на фоне этого снижается количество продуктов ПОЛ, в том числе ДК и МДА. Это необходимо для обеспечения процессов имплантации в слизистую матки, развития плаценты и создания оптимальных условий, которые позволят, с одной стороны – обеспечить надежную защиту организма женщины, а с другой – вынашивание беременности. Данная закономерность имеет глубокий биологический смысл и направлена на обеспечение условий для реализации репродуктивной функции человека.

В данной работе мы не учитывали возможность влияния динамики репродуктивного цикла женщин на уровень продуктов ПОЛ, хотя это явление могло отразиться на полученных результатах.

Во время гестации, начиная с момента зачатия и до завершения родов, в организме матери возникают интегративные процессы, которые необходимы для поддержания функционального единства организма матери и плода. Эти процессы позволяют выполнить главную задачу, то есть сохранение плода, и заключается в адаптации в I триместре беременности.

Несмотря на то, что в антигенном отношении мать и плод всегда несовместимы, в большинстве случаев после имплантации бластоцисты беременность развивается нормально и завершается родами в срок. Если бы взаимоотношения между матерью и плодом строились по варианту реципиент – аллотрансплантат, то беременность вряд ли продолжалась дольше срока, чем выживание обычного трансплантата. Следовательно, в системе "мать – плод" существуют механизмы, направленные на сопереживание двух антагонистически настроенных субъектов.

В данной работе было определено содержание ДК и МДА в плазме крови у беременных женщин (N=96), разделенных по триместрам, в возрасте от 20 до 28 лет.

Группу сравнения составили небеременные женщины. Результаты определения уровня ДК и МДА приведены на рисунках 8 и 9.

Рис. 8. Содержание диеновых коньюгатов в плазме крови женщин в динамике беременности

У женщин в I триместре беременности наблюдается достоверное повышение уровня продуктов ПОЛ по сравнению с контролем. Так, содержание ДК и МДА повысилось на 74 и 77% соответственно. Это можно объяснить тем, что сразу же после зачатия происходит значительная перестройка жизнедеятельности организма беременных женщин, которая сопряжена с изменениями в системах крови, гемостаза, эндокринной, иммунной системах и с изменением биохимического состояния организма в целом. «Не ожидая» подобных изменений, ткани и органы испытывают определенный стресс, в результате которого резко повышается количество свободных радикалов, атакующих, помимо прочего, клетки плаценты и эмбриона.

Увеличение количества свободных радикалов (СР) во время беременности связано с различными причинами. Одной из причин является их участие в синтезе прогестерона. СР активируют процесс перекисного окисления липидов, в результате которого образуются гидроперекиси холестерина, являющиеся предшественниками данного гормона.

Прогестерон является очень важным гормоном, необходимым для поддержания всего течения беременности. Он подготавливает эндометрий матки к имплантации оплодотворенной яйцеклетки, а затем способствует сохранению беременности: подавляет активность гладкой мускулатуры матки, поддерживает в центральной нервной системе доминанту беременности; стимулирует развитие концевых секреторных отделов молочных желез и рост матки, синтез стероидных гормонов; оказывает иммунодепрессивное действие, подавляя реакцию отторжения плодного яйца [Савченко с соавт., 2006].

Рис 9. Концентрация прогестерона при разных сроках беременности

Кроме того, прогестерон является предшественником стероидных гормонов плода, а так же эстрогенов, андрогенов, альдостерона и других гормонов коры надпочечников. Содержание прогестерона в крови беременной женщины увеличивается, повышаясь в 2 раза к 7-8 неделе, а затем более плавно возрастает к 34 недели (Рис 9). Следовательно, интенсификация процессов перекисного окисления липидов во время беременности является физиологически необходимым процессом.

Гормональные связи «пронизывают» все компоненты функциональной системы мать-плацента-плод. Так, в I триместре беременности происходит тесное взаимодействие материнско-плацентарной эндокринной системы, а во II и особенно в III триместрах плод и плацента выступают как общий орган синтеза эстрогенов.

Дальнейший анализ полученных нами данных показал, что уровень как МДА, так и ДК во II триместре беременности продолжает достоверно расти как по сравнению с группой контроля, так и c I триместром беременности.

Концентрация ДК во II триместре беременности увеличилась по сравнению с группой небеременных женщин и I триместром на 151 и 69% соответственно. Содержание МДА возросло на 97 и 11% так же по сравнению с контролем и I триместром беременности.

Сравнение уровней содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ во II триместре беременности по сравнению с I триместром показал более выраженный прирост концентрации диеновых коньюгатов по сравнению с малоновым диальдегидом. Этому явлению можно найти несколько объяснений.

Во-первых, из литературных данных известно, что МДА может метаболизироваться. В этом процессе принимает участие альдегиддегидрогеназа. Наличие такого фермента отмечено в плазме крови [Соловьева, 2007].

Во-вторых, МДА является чрезвычайно реакционноспособным соединением, способным вступать в образование шиффовых оснований с соединениями, содержащими NH2-группы. К такому роду соединений относятся аминокислоты, низкомолекулярные пептиды и прочие соединения. В этом случае часть МДА извлекается из пула свободного МДА, образуя так называемый «связанный» МДА, концентрация которого, как показали некоторые исследования, повышается при ряде патологических состояниях. Используемая нами методика позволяет определить только свободный МДА без учета связанного МДА.

В-третьих, нельзя исключить, что метаболизм продуктов липопероксидации во II триместре такой, что скорость превращения ДК в МДА снижена.

В III триместре содержание ДК в плазме крови беременных женщин достигает своего максимума и составляет 1,07 ммоль/л. Уровень МДА так же повышается по сравнению с контролем и вторым триместром на 160 и 31% соответственно.

Согласно литературным данным повышение продуктов ПОЛ в III триместре беременных обусловлено угнетением ферментативных и неферментативных механизмов антиперекисной защиты. Происходит снижение активности каталазы [Гусак, 2007] и церулоплазмина (ЦП) [Качалина, Морозова, 2003]. ЦП обладает ферроксидазной активностью, а так же ингибирует супероксидный анион-радикал, избыток которого приводит к усилению процесса ПОЛ.

Кроме того, в плазме крови церулоплазмин совместно с трансферрином образует антиоксидантную систему, регулирующую концентрацию восстановленных ионов железа, и суммарная антиокислительная активность плазмы крови в отношении Fe2+ -индуцированного ПОЛ в основном определяется содержанием в ней данных компонентов [Меньщикова, 2006].

Так же в III триместре беременности происходит возбуждение адренергических структур гипоталамуса, что приводит к увеличению соотношения адреналин/серотонин, депрессии антиоксидантного потенциала плазмы крови и активации иммуногенеза [Гусак, 2007].

Усиление процессов перекисного окисления липидов в крови беременных женщин может быть связано с различными причинами.

Чрезмерное и бесконтрольное увлечение препаратами железа может стать причиной увеличения числа свободных радикалов, так как любой антиоксидант в определенных условиях может выступать прооксидантом, инициируя окислительные процессы [Меньщикова с соавт., 2006]. В то же время дефицит железа может способствовать развитию железодефицитной анемии (ЖДА), следствием которой является тканевая гипоксия [Мусаев, 2004].

По данным литературы длительная гипоксия приводит к истощению АОС, что влечет за собой неконтролируемый процесс липопероксидации и накопление продуктов свободно-радикального окисления, оказывающих неблагоприятное влияние на систему мать-плацента-плод [Евсюкова, Савельева, 2005].

Другой причиной является образование активных форм кислорода при применении лекарственных средств. Подвергаясь всевозможным ферментативным превращениям в организме, молекулы некоторых лекарств теряют свои электроны в этих химических реакциях, превращаясь в свободные радикалы.

Состояние стресса так же оказывает мощное влияние на активацию процессов ПОЛ. Гормоны стресса, адреналин и кортизол, при неблагоприятных жизненных ситуациях вырабатываются в повышенных количествах, нарушая питание и нормальное дыхание клетки, что моментально приводит к накоплению и распространению радикалов во всем организме.

Так же важно отметить, что беременные женщины подвергаются регулярному влиянию неблагоприятных факторов окружающей среды: загрязненный воздух, табачный дым, ультрафиолетовое излучение. Это усугубляет процесс физиологического течения беременности при условии дефицита антиокислителей. Кроме того данные литературы свидетельствуют о корреляции окислительного напряжения организма матери и неблагоприятным результатом беременности, в том числе выкидыше.

3. Уровень ДК в плазме крови в I и II триместрах беременности достоверно повышается на 74 и 151% соответственно по сравнению с группой контроля. В III триместре концентрация диеновых коньюгатов достигает своего максимума и составляет 1,07 ммоль/л.

Банкова В.В. Деградация малонового диальдегида в эритроцитах и ее возрастные, сезонные и суточные изменения / В.В. Банкова, Т. М. Никанорова // Вопр. мед. Химии, 1988. - № 6. - С. 27-29.

Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов / В.А. Барабой // Успехи соврем. Биологии, 1991. - Т. 111. - № 6. - С. 923-931.

Барабой В.А. Перекисное окисление и стресс / В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Голожин с соавт. - М.: Наука, 2004. - 148 с.

Бобырев В.Н. Специфичность систем антиоксидантной защиты органов и тканей – основа дифференцированной фармакотерапии антиоксидантами / В.Н. Бобырев, В.Ф. Почерняева, С.Г. Стародубцев // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2005. – Т. 57. - №1. - С. 78-86.

Бондарь Т.Н. Восстановление органических гидроперекисей глутатионпероксидазой и глутатион-S-трансферазой: влияние структуры субстрата / Т.Н. Бондарь, В.З. Ланкин, В.А. Антоновский // Докл. АН СССР, 1989. - T. 304. - №1. – С. 217-220.

Булгакова Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты / Булгакова Е.Б. // Успехи химии, 2006. - № 9. – 250 c.

Бурлакова Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран / Е.Б. Бурлакова, Н.Г. Храпова // Успехи химии, 2004. - Т. 54. - C. 1540-1558.

Бурлакова Е.Б. Роль токоферолов в пероксидном окислении липидов биомембран / Е.Б. Бурлакова, С.А. Крашков, Н.Г. Храпова // Биологические мембраны, 1998. - Т. 15, № 2. - С. 137-167.

Василец И.М. Церулоплазимины. Их молекулярная структура и биологические функции / И.М. Василец // Успехи биол. Химии, 2004. - № 14. - С. 172-200.

Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биомембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 2003. – С. 230-272.

Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова, А.И. Деев с соавт. // Итоги науки и техники, 2000. – Т. 29. - С. 151-167.

Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестн. РАМН, 1998. - № 7. - С. 43-51.

Воейков В.Л. Благотворная роль активных форм кислорода / В.Л. Воейков // Биохимия, 2004. - № 1 - С. 27-38.

Воскресенский О.Н. Перекиси липидов в живом организме / О.Н. Воскресенский, А.П. Левицкий // Вопр. мед. Химии, 2003. - Т. 16. - № 6. – С. 563-583.

Воскресенский С.К. Антиоксидантная система, онтогенез и старение / С.К. Воскресенский, И.А. Жутаев, В.Н. Бобырев с соавт. // Вопр. мед. Химии, 2004. - № 1. - C. 14-27.

Гусак Ю.К. Психонейроиммунологические особенности адаптивных механизмов нормального репродуктивного цикла у женщин [Электронный ресурс] / Ю.К. Гусак, Ю.В. Лазарева, В.Н. Морозов, 2006. – Режим доступа: http:www.mednet.сom

Гусак Ю.К. Психонейроиммунологические особенности адаптивных механизмов при нормально протекающей беременности [Электронный ресурс] / Ю.К. Гусак, Ю.В. Лазарева, В.Н. Морозов, 2007. - Режим доступа: http:www.mednet.сom

Дубина Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментной антиоксидантной защиты плазмы крови человека / Е.Е. Дубина // Биохимия, 2005. - Вып. 2. – С. 3-18.

Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма / Е.Е. Дубинина // Успехи современной биологии, 2004. - Т. 108. - №1. – C. 3-17.

Евстигнеева Р.П. Витамин Е как универсальный антиоксидант и стабилизатор биологических мембран / Р.П. Евстигнеева, И.М. Волков, В.В. Чудинова // Биол. Мембраны, 2003. - № 2. С. 119-137.

Евсюкова И.И. Свободнорадикальное окисление у доношенных новорожденных детей с различной патологией / И.И. Евсюкова, Т.В. Савельева // Педиатрия, 2005. - №1. – С. 13-16.

Журавлев А.И. Биоантиокислители в живом организме / А.И. Журавлев. - М.: Наука, 2003. - C. 19-30.

Журавлева Т.Д. Возрастные особенности свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной защиты в эритрацитах здоровых людей / Т.Д. Журавлева, С.Н. Суплотов, Н.С. Киянюк с соавт. // Вопр. мед химии, 2003. - № 5. - C. 17-18.

Зборовская В.А. Антиоксидантная система организма, ее значение в метаболизме / В.А. Зборовская, М.В. Банникова // Вестник РАМН, 2000. - № 6. - С. 53-63.

Зенков Н.К. Окислительный стресс / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньщикова. - М.: Наука, 2004. - 343с.

Качалина Т.С. Прогностическая значимость определения церулоплазмина в третьем триместре беременности [Электронный ресурс] / Т.С. Качалина, Т.А. Морозова, 2006. – Режим доступа: http: www.iprit.ru/ chemical agents action=1179

Кения М.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.П. Кения, А.И. Лукаш, Е.П. Гуськов // Успехи современной биологии, 1993. - Т. 113. - № 4. - С. 456-468.

Колесниченко Л.С. Глутатионтрансферазы / Л.С. Колесниченко, В.И. Кулинский // Успехи совр. Биологии, 2004. - Т. 107. - вып. 2. - С. 179-193.

Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высш. школа, 1998. - 293с.

Меньщикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем. Биологии, 1993. - Т. 113. - №4. - C. 442-453.

Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков с соавт. - М.: «Слово», 2006. – 553 с.

Мусаев А.Т. Диагностика гипоксии плода по данным показателей перекисного окисления липидов и антиокислительной активности / А.Т. Мусаев // Педиатрия, 2004. - № 12. – С. 88-96.

Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи соврем. биологии, 2003. - Т. 31. - C. 180-208.

Осипов А.Н. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа / А.Н. Осипов, Э.Ш. Якутова, Ю.А. Владимиров // Биофизика, 2003. – Т. 38. - вып 3. – С. 390-396.

Петрович Ю.А. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса / Ю.А. Петрович, Д.В. Гуткин // Патол. физиол. и экперим. Терапия, 2005. - № 5. - С. 85-92.

Савченко А.А. Система мать-плацента-плод. Вопросы функциональной диагностики / А.А. Савченко, Н.М. Титова, Л.А. Новикова с соавт. - Красноярск: РИО КрасГУ, 2006. – 129 с

Соловьева А.Г. Активность альдегиддегидрогеназы в эритроцитах, тромбоцитах и плазме крови крыс в норме и при ожоге / А.Г. Соловьева // Успехи соврем. Естествознания, 2007. - № 12. – С. 12-15.

Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных высших жирных кислот / И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии под ред. Ореховича В.Н., 1997. - С. 63-64.

Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии под ред. Ореховича В.Н., 1997. - C. 66-68.

Суханова Т.А Патохимия клетки / Т.А. Суханова // Успехи соврем. биологии, 2004. – Т. 40. – С. 82-104.

Тиунов Л.А. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты / Л.А. Тиунов // Вестн. РАМН, 1995. - № 3. - C. 9-13.

Хавинсон В.Х. Свободнорадикальное окисление и старение / В.Х. Хавинсон, В.А. Баринов, А.В. Арутюнян с соавт. - СПб.: Наука, 2003. - С. 10-122.

Шепелев А.П. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А.П. Шепелев, И.В. Корниенко, А.В. Шестопалов с соавт. // Вопр. мед. Химии, 2004. - № 2. - С. 15-17.

Якутова Э.Ш. Образование свободных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа / Э.Ш. Якутова, Е.С. Дремина, С.А. Евгина с соавт. // Биофизика, 2004. – Т. 39. - вып. 2. – С. 275-279.

Abiaka C. Effect of Prolonged Storage on the Activities of Superoxide Dismutase, Glutathione Reductase, and Glutathione Peroxidase / C. Abiaka, F. Al-Awadi, S. Olusi // Clinical Chemistry, 2003. - Vol. 46. - Issue 4 - P. 560-576.

Auchere F. What is the ultimate fate of superoxide anion in vivo? / F. Auchere, F. Rusnak // J. Biol. Inord. Chem., 2005. - Vol. 7 - P. 664-667.

Beyer R. E. The participation of coenzim Q in free radical production and antioxidation / R. E Beyer // Free Radic. Biol. Med., 2004. – Vol. 8. – P. 545-565.

Birringer M. Vitamin E analogues as inducers of apoptosis: structure-function relation / M. Birringer, J. H. EyTina, B A. Salvatore // Br. J. Cancer., 2003. – Vol. 88. – P. 1948-1955.

Carole B. Rudra A prospective study of early-pregnancy plasma malondialdehyde concentration and risk of preeclampsia / Carole B. Rudra, Chunfang Qiu, Robert M. David at аl. // Clinical Biochemistry, 2006. – Vol. 39. – P. 722-726.

Chen R. Microdialysis sampling combined with electron spin resonance for superoxide radical detection in microliter samples / R. Chen, J. T. Warden, J. A. Stonken // Anal. Chem., 2004. - Vol. 76. - P. 4734-4740.

Cord J.M. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) / J. M. Cord, I. Fridovich // J. Biol. Chem., 2000. - Vol. 244. - Issue 22. - P. 6049-6055.

Dix T.A. Mechanisms and biological significance of lipid peroxidation initiation / T.A. Dix, J. Aikens // Chem. Res. Toxicol., 2005. - Vol. 6. - Р. 2-18.

Eisenberg W. C. Cytogenetic effects of singlet oxygen / W. C. Eisenberg, K. Taylor, R. R. Guerrero // J Photochem. Photobiol., 2002. – Vol. 16. – P. 381-384.

Galeotti T. Oxy-radical metabolism and control of tumour growth / T. Galeotti, L. Masotti, S. Borello // Xenobiotika, 2003. – Vol. 21. – P. 1041-1052.

Gutteridge J. M. C. Lipid peroxidation and antioxidation as biomarkers of tissues damage / J. M. C. Gutteridge // Clinikal Chemistry, 2005. - Vol. 41. - №12. - P. 1819-1828.

Halliwell B. Oxygen toxiciti, oxygen radicals, transition metals and disease / B. Halliwell, J. M. C Gutteridge // Biochem., 2004. – Vol .215. - P. 1-14.

Kira, Y. Association of Cu-Zn-type superoxide dismutase with mitochondria and peroxisomes / Y.Kira, E. F. Sato, M. Inoue // Arsh. Biochem. Biophys., 2003. – Vol. 399. – P. 96-102.

Klebanoff, S. J.Myeloperoxidase: role in neutrophil – mediated toxicity / S. J. Klebanoff // Molecular Biologi and Infectious Diseases., 2006. – Vol. 24. - P. 283-289.

Krsek-Staples, J.A. Ceruloplasmin inhibits carbonyl formation in endogenous cell proteins / J. A. Krsek-Staples, R. O. Wbster // Free Radic Biol. Med., 2004. - Vol. 14. - Р. 115-25.

Maiorino, M. Prooxidant role of vitamin E in copper induced lipid peroxidation / M. Maiorino, A. Zamburlini, A. Roveri // FEBS Lett., 2005. – Vol. 330. – P. 174-176.

Melov, S. Animal models of oxidative stress, aging and therapeutic antioxidant interventions / S. Melov // Int. J. Biochem. Cell Biol., 2003. – Vol. 34. – P. 1395-1400.

Meral, A. Lipid peroxidation and antioxidant status in beta-thalassemia / A. Meral, P. Tuncel, E. Surmen-Gur // Pediatr. Hematol. Oncol., 2000. - Vol. 17. - P. 687-693.

Michiels, C. Cytotoxicity of linoleic acid peroxide, malondialdehyde and 4-hydroxynonenal towards human fibroblast / C. Michiels, J. Remacle // Toxicology, 2004. - Vol. 66. - №2. - P. 225-234.

Okado-Matsumoto, A. Subcellular distribution of superoxide dismutases in rat liver: Cu,Zn-SOD in mitochondria / A. Okado-Matsumoto, I. Fridovich // J. Biol. Chem., 2003. - Vol. 276. - P. 38388-38393.

Padayatty, S. J. Vitamin C as an Antioxidant: Evaluation of Its Role in Disease Prevention / S. J. Padayatty, A. Katz, Y. Wang // Journal of the American College of Nutrition, 2003. - Vol. 22. - Р. 18-35.

Thomas, J. P. Enzymatic reduction of phospholipid and cholesterol hydroperoxides in artificial bilayers and lipoproteins / J. P. Thomas, P. G. Geiger, M. Maiorino et al. // Biochim. Biophys. Acta., 2006. – Vol. 1045. – P. 252-260.

Tohoku, J. Nitric Oxide, Lipid Peroxides, and Uric Acid Levels in Pre-Eclampsia and Eclampsia / J Tohoku // Biochem., 2004. – Vol. 15. - P. 87-92.

Ursini, F. The role of selenium peroxidases in the protection against oxidative damage of membranes / F. Ursini, A. Bindoli // Chem. Phys. Lipids., 2005. – Vol. 44. – P. 255-276.

Wendel, T. Enzimes acting against reactive oxygen / A Wendel // Enzymes, 2004. – Vol. 34. – P. 161-167.

Young-Ju Kim Oxidative stress in pregnant women and birth weight reduction / Young-Ju Kim, Yun-Chul Hong, Kwan-Hee Lee // Reproductive Toxicologi, 2005. – Vol. 19. – P. 487-492.

The present work is devoted to the mechanisms of lipid peroxidation and antioxidant defence. A special attention is paid to the experimental research of the products of lipid peroxidation.

The purpose of this work is measuring of the level of MDA and DС in blood plasma of women in different stages of pregnancy.

The maintenance of a recreation center DС and MDA in plasma of blood of not pregnant women has made 0,26 - 0,54 mmol/l and 0,64-1,28 µmol/l accordingly.

The level of a recreation center in plasma of blood in I and II trimesters of pregnancy authentically raises on 74 and 151 % accordingly in comparison with group of the control. In III trimester concentration DС reaches the maximum and makes 1,07 mmol/l.

Maintenance MDA in plasma of blood in I, II, III trimesters of pregnancy progressively increases for 77, 97, 160 % accordingly in comparison with group of not pregnant women.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ГОМЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Медико-диагностический факультет

Кафедра клинической лабораторной диагностики

Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов

Курсовая работа

Исполнитель: Подстреха Елена Станиславовна

студентка группы Д-503

Научный руководитель: заведующая кафедрой, доктор медицинских наук, доцент Новикова Ирина Александровна

ГОМЕЛЬ 2016г

Реферат

В работе проведен анализ литературы об исследовании ферментативных и неферментативных путях образования активных форм кислорода, механизмы их повреждающего воздействия на живые клетки, в частности инициация свободнорадикального перекисного окисления липидов. Рассмотрены анти- и прооксидантные системы защиты организма, осуществляющие баланс между возникновением, метаболизмом и утилизацией активных форм кислорода.

Курсовая работа 35 страниц, 1 таблица, 17 источников.

Перечень ключевых слов: перекисное окисление липидов, свободно - радикальное окисление, активные формы кислорода, антиоксидантная защита, малоновый диальдегид.

Перечень сокращений

Введение

Роль свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в организме человека

1 Формы свободных радикалов в организме

2 Общая характеристика основных АФК, их биологическая роль

3 Физиологическая роль свободнорадикального окисления

4 Регуляция свободно-радикального окисления

5 Система антиоксидантной защиты организма

6 Патогенетические механизмы нарушений, развивающиеся при нарушении баланса антиоксидантной и прооксидантной систем

Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

1 Участие АФК и продуктов ПОЛ в патогенезе заболеваний человека

2 Диагностика процессов перекисного окисления

Заключение

Перечень условных обозначений

АОА - антиоксидантная активность

АО - антиоксидант

АФК - активные формы кислорода

ГР - глутатионредуктаза

ГП - глутатионпероксидаза

МП - миелопероксидаза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободно-радикальное окисление

ХЛ - хемилюминесценция

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

Введение

перекисный окисление липид активный кислород

В организме в результате окислительно-восстановительных реакций постоянно происходит генерация активных форм кислорода (АФК), которые обладают высокой реакционной способностью, вызывая, в частности, окислительную модификацию биополимеров: белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов. Радикалы кислорода, несмотря на свою реакционность и потенциальную токсичность, в малых концентрациях являются нормальными метаболитами множества биохимических реакций в клетке. В физиологических условиях свободно-радикальные реакции протекают на низком уровне. Процессы, протекающие с участием радикалов кислорода, свидетельствует о важной роли этих соединений в поддержании гомеостаза, формировании резистентности организма против инфекций, обеспечении регенерации тканей и органов. Если процесс генерации АФК усиливается, это может явиться и является пусковым фактором развития целого перечня разнообразных патологических процессов.

Актуальность углубленной разработки проблемы патогенетической значимости свободнорадикального перекисного окисления обуславливается нарастающим экологическим неблагополучием. Изучение этого важного звена гомеостаза имеет непосредственное прикладное значение, т. к. позволяет разрабатывать и применять адекватные профилактические подходы, предупреждающие запуск цепной реакции свободнорадикального окисления или нейтрализующие токсичность продуктов ПОЛ.

1. Роль свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в организме человека

Системы, участвующие в образовании АФК, и процессы, связанные с окислительной альтерацией биологических соединений, условно объединены понятием прооксидантная система.

К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа.

Окислительные реакции - основа энергообразования и жизнедеятельности всех клеток организма человека. Они могут протекать без присоединения кислорода (оксидазные реакции) и с присоединением молекулярного или атомарного кислорода - оксигеназные реакции. Промежуточными продуктами последних является перекиси и эпоксиды, поэтому такие реакции называются перекисным окислением. Оно индуцируется высокореактивными свободными радикалами.

В физиологических условиях интенсивность перекисных процессов незначительна и поддерживается на стационарном уровне благодаря многокомпонентной системе нейтрализации постоянно образующихся свободных радикалов - антиоксидантной системе.

Образование прооксидантов в тканях уравновешивается активностью внутри- и внеклеточных антиоксидантов, формируя определенный оптимальный уровень прооксидантно-антиоксидантного равновесия .

1.1 Формы свободных радикалов в организме

Известно множество окислительно-восстановительных реакций, в ходе которых образуются различные виды свободных радикалов. Свободные радикалы были открыты в конце прошлого столетия. К настоящему времени их описано более 8000. Свободные радикалы являются высокоактивными соединениями, которые образуются в физиологических условиях как вторичные продукты в процессе метаболизма, а также другими путями, включая редокс-реакции, осуществляемые путем одноэлектронного переноса; гомолиз инициаторных молекул, обладающих слабой ковалентной связью, радиолиз; фотолиз, термолиз.

Многие ксенобиотики, включая различные лекарственные препараты, алкоголь и др., метаболизируются в организме, генерируя свободные радикалы. Несмотря на большое разнообразие их происхождения и структуры, свободные радикалы подразделяются на 3 большие группы: 1) радикалы реактивного кислорода (ROS); 2) радикалы реактивного азота (RNS); 3) радикалы реактивного хлора (RCS) .

Свободный радикал - это молекула, атом или группа атомов, имеющих неспаренный электрон на внешней атомной орбитали. АФК являются активными участниками большого числа химических реакций в клетках, оказывая разнообразное физиологическое действие .

Отличительные особенности свободных радикалов:

наличие неспаренного электрона на внешнем энергетическом уровне;

собственный магнитный момент;

высокая химическая активность и малое время жизни;

способность инициировать цепные реакции окисления;

Наиболее вероятно появление свободных радикалов в организме при последовательном присоединении электронов к кислороду и во время свободнорадикального перекисного окисления липидов.

Основные процессы, ведущие к образованию свободных радикалов в организме:

последовательное присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности;

микросомальное и митохондриальное окисление, фагоцитоз;

ферментативные реакции с участием гидролаз, оксидаз, дегидрогеназ;

реакции автоокисления и биосинтеза (тиолы, катехоламины и т. д.);

окисление чужеродных соединений - ксенибиотиков, некоторых лекарственных препаратов;

действие негативных факторов среды (физические и химические инициаторы окисления);

фотохимические процессы;

перекисное окисление липидов.

модификация физико-химических свойств биологических мембран;

защитные функции, окисление чужеродных соединений, микробицидное действие;

обмен веществ, аккумуляция и биотрансформация энергии;

влияние на иммунитет, передачу информации.

Наиболее распространенные в организме формы свободных радикалов:

Активные формы кислорода:

О˙2 - супероксидный анион радикал;

¹O2 - синглетная форма кислорода;

OH˙ - гидроксильный радикал;

Н2О2 - перекись водорода;

Окисленные галогены: CLO˙ - гипохлорид, хлорамины;

Окислы азота: NO˙ - оксид азота;

Свободные радикалы образующиеся при перекисном окислении липидов: RO˙, RO2˙- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот.

2 Общая характеристика основных АФК, их биологическая роль

Радикалы кислорода образуются в ходе процессов, связанных с транспортом электронов по дыхательной цепи. В обычных условиях на генерацию АФК расходуется от 1 до 5 % потребляемого кислорода. Однако эта величина может существенно возрастать при изменении кислородного бюджета организма - при гипероксии или гипоксии. В результате последовательного восстановления молекулярного кислорода происходит образование супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала.

Супероксиданион-радикал (О˙2) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии. Радикал является относительно слабым окислителем и во многих биологических системах выступает в качестве донора электронов, восстанавливая ряд соединений. При взаимодействии с протоном О2 переходит в гидроперекисный радикал. Кроме этого, именно он является потенциальным источником гидроксильного радикала и перекиси водорода.

Супероксиданион-радикал - более реакционноспособное соединение, чем кислород. В организме супероксиданион-радикал представляет собой промежуточный продукт многих биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков. Из источников супероксиданион-радикала наибольший интерес представляют гемоглобин, миоглобин, восстановленный цитохром С, НАДФН-оксидазы фагоцитирующих клеток и др. Основным источником радикала в крови являются нейтрофилы, генерирующие его при ряде реакций специфического и неспецифического иммунитета. Еще один фермент, специализированный на образовании супероксиданион-радикала - это ксантиноксидаза, которая в нормальных условиях находится преимущественно в дегидрогеназной форме и может обратимо и необратимо переходить в оксидазную форму, что происходит при ишемии. Считается, что генерация радикала ксантиноксидазой необходима для метаболизма железа, регуляции тонуса сосудов и клеточной пролиферации, обеспечения микробицидного потенциала нейтрофилов.

Супероксиданион-радикал - пусковое звено каскада свободно-радикальных реакций, приводящих к возникновению большинства АФК и продуктов ПОЛ. Он участвует в синтезе хемотаксических пептидов, усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, ингибирует действие эндотелиального фактора расслабления, может повреждать мембраны эритроцитов, ингибировать Са2+-АТФ-азу, синтез РНК и белка эндотелиальных клеток, окислять белки сыворотки, в то же время его непосредственная цитотоксичность невелика.

Для регуляции уровня О˙2 в клетках служит высокоспецифичный фермент антиоксидант - супероксиддисмутаза, которая обладает способностью существенно ускорять реакции дисмутации радикала в перекись водорода.

Перекись водорода (Н2О2). Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону О2 сопровождается образованием двухзарядного аниона О22ˉ, который переходит в НО2˙ или перекись водорода. Перекись водорода относят к окислителям средней силы; в отсутствие ферментных антиоксидантов и ионов металлов переменной валентности она относительно стабильна и может мигрировать в клетки и ткани. Перекись водорода оказывает ограниченное повреждающее действие, вызывая, в частности, нарушение гомеостаза кальция в клетке. В организме ее источниками являются реакции с участием оксидаз (ксантиноксидазой, оксидазой L-аминокислот и рядом других), переносящими два электрона на молекулу кислорода, а также реакция дисмутации супероксиданион-радикала, катализируемая супероксиддисмутазой. Эта реакция является источником почти 80 % перекиси водорода в очаге воспаления.

Перекись водорода является промежуточным продуктом при образовании большинства АФК. Н2О2 - один из источников возникновения наиболее токсичного из АФК - гидроксильного радикала. В присутствии миелопероксидазы из нее происходит образование высокореакционных гипогалоидов - НОС1, HOBr, HOJ, HOSCN.

В обычных условиях клетки млекопитающих достаточно устойчивы к воздействию перекиси водорода благодаря наличию ферментов - глутатионпероксидазы и каталазы. Молекулы Н2О2 выполняют ряд регуляторных функций в клетке. Перекись может служить в качестве метаболического сигнала для индукции экспрессии генов, осуществляющих синтез структурных и функциональных белков в клетке.

Гидроксилъный радикал (НО˙) является наиболее реакционноспособным и, соответственно, токсичным из всех АФК, образующихся в биологических системах. Радикал может разрывать любую углеводородную связь, при этом скорость его взаимодействия с органическими субстратами достигает величин, равных скорости диффузии (т. е. 107-1010 моль/с, что в 106 раз выше, чем для супероксиданион-радикала и перекиси водорода). По сравнению с другими АФК, НО˙ обладает наиболее высоким редокс-потенциалом, равным + 2,7, что позволяет ему атаковать и разрушать любые макромолекулы практически на месте в момент появления.

Основным источником гидроксильного радикала является реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом, с Fe2+, по схеме Н2О2 + Fe+2 → Fe+3 + ОН + ОН˙. Образование радикала также происходит в ходе окисления арахидоновой кислоты, в реакции Габер-Вейса, Осипова, при микросомальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и CoQ. Обратное восстановление Fe3+ возможно в реакции с О2, а также при взаимодействии с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином и другими окисляющими соединениями. Показано, что цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений напрямую связано с образованием гидроксильного радикала в процессе радиолиза воды. НО˙ также участвует в реализации микробицидного и цитотоксического действия гранулоцитов, моноцитов и Т-лимфоцитов. Гидроксильные радикалы вызывают повреждения нуклеиновых кислот, белков, а также других клеточных структур, ингибируют ряд фракций комплемента. Они индуцируют образование органических радикалов и таким образом запускают процессы ПОЛ. Ввиду высокой неспецифичности реакций радикала с разными органическими молекулами, его взаимодействие носит цепной характер. Важно отметить, что в организме нет специализированных ферментных систем, обладающих способностью инактивировать гидроксильный радикал. Низкомолекулярные соединения, такие как урацил, мочевая кислота, салицилаты, глюкоза, диметилсульфоксид, обладают способностью ингибировать ОН˙ радикал только при достаточно высоких концентрациях. Таким образом, при целом ряде патологических состояний, сопровождающихся избыточным образованием АФК и, соответсвенно, гидроксильного радикала, организм становится практически беззащитным перед повреждающим действием этого соединения. Предотвращение повреждений клеточных структур осуществляется только за счет снижения концентрации радикалов - предшественников ОН, в частности, супероксиданион-радикала и перекиси водорода. Способностью разрушать эти радикалы-предшественники обладают СОД и каталаза.

Синглетный кислород(¹O2). Образуется при изменении спина одного из электронов р-орбитали в молекуле кислорода. Возникновение ¹O2 как сопутствующего продукта отмечено во многих ферментативных реакциях с участием СОД, каталазы и пероксидаз, а также в реакциях с участием большинства АФК. Так, в реакции разложения перекиси водорода каталазой до 1%, образующегося кислорода возникает в синглетном состоянии. Синглетный кислород обладает высокой реакционной способностью и легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями. Он часто выступает в качестве индуктора реакций ПОЛ. Хотя ¹О2 обладает цитотоксическим действием и принимает участие в реализации микробиоцидного действия гранулоцитов, его вклад в эти процессы не является определяющим. Одним из наиболее эффективных гасителей синглетного кислорода в клетке является бета-каротин, одна молекула которого способна потушить около 1000 его молекул прежде, чем подвергнется окислительной деструкции .

АФК выступают в качестве вторичных посредников в процессах жизнедеятельности клеток. Включаясь в сигнальную трансдукцию, АФК влияет на ключевые звенья метаболических процессов: фосфорилирование, метаболизм Са2+, модуляция факторов транскрипции, гидролиз фосфолипидов. При любых стрессорных реакциях организма, сопровождающихся состоянием окислительного стресса, АФК участвуют в передаче сигнала от первичных посредников для запуска каскада реакций, необходимых для приспособления и выживания в экстремальных условиях.

Каждая ткань обладает определенной буферной ёмкостью АОЗ. Она зависит от состояния АОЗ межклеточной жидкости и самой клетки, отдельных её компонентов. Некоторые ткани в силу особенностей своей функциональной и метаболической активности обладают высокой чувствительностью к состоянию окислительного стресса, это связано с высокой потенциальной мощностью прооксидантной системы и низкой буферной емкостью АОЗ. К таким тканям относятся мозг, сетчатка, легкие. Это обусловлено важной регуляторной функцией, которую выполняют генерируемые АФК и радикальные метаболиты в этих тканях. В мозговой ткани это связано с передачей сигналов возбуждения, возникновения потенциала действия и включения в работу синапсов.

АФК - вторичные мессенджеры.

Метаболический фон любой клетки зависит от характера информации, поступающей из окружающей среды. Носителями этой информации являются первичные мессенджеры: гормоны, цитокины, нейротрасмиттеры. Этот процесс осуществляется за счет клеточной сигнализации или сигнальной трансдукции. А в передачу сигнала через клеточную мембрану включаются вторичные мессенджеры. В качестве вторичных посредников принимают активное участие АФК. Они осуществляют регулирующую роль в процессах роста клеток, апоптозе, клеточной адгезии, свертывания крови и т. д. Низкие (микромолярные) концентрации АФК увеличивают рост или усиливают ответ на стимуляцию роста во многих типах клеток, а антиоксиданты подавляют нормальную клеточную пролиферацию. Низкие концентрации Н2О2 стимулируют рост фибробластов. Ингибирование СОД или глутатионпероксидазы увеличивает клеточную пролиферацию. ОН˙, являться фактором, усиливающим клеточную пролиферацию и активность митоген-активируемой протеинкиназы (МАР-киназа).

В физиологических концентрациях АФК в роли вторичных посредников образуется опосредованно через лиганд-рецепторное взаимодействие. В качестве таких лигандов могут выступать гормоны (инсулин, ангиотензин, паратиреоидный гормон, витамин Дз), цитокины, факторы роста. Образование лиганд-рецепторных комплексов сопровождается образованием АФК, которые активно включаются в сигнальную трансдукцию, влияя на ключевые звенья метаболических процессов в клетке.

Первичные мессенджеры осуществляют регуляцию уровня АФК в клетке за счет активации процессов их генерации с одной стороны и снижения активности отдельных звеньев АОЗ с другой. В этом процессе активное участие принимают цитокины. Цитокины стимулируют освобождение АФК из многих типов клеток, включая фибробласты человека, эпителиальные и эндотелиальные клетки. С АФК связана передача сигнала от тромбоцитарного фактора роста, эпидермального фактора роста, трансформирующего фактора роста β-1, фактора некроза опухолей. Участие интерлейкина-1 и интерферона в сигнальной трансдукции связывают с образованием О2ˉ, а ФНО - с Н2О2.

АФК выполняют роль вторичных мессенджеров и в клетках костной ткани. ФНО, интерлейкин-1, паратиреоидный гормон и витамин Д стимулируют образование АФК за счет присутствующей в

остеокластах НАДФН-оксидазы. Вазоактивный пептид (ангиотензин II) проявляет свое действие на процессы мышечного сокращения и клеточный рост гладких мышц сосудов через генерацию внутриклеточного О˙2ˉ. Источником О˙2ˉ являлись НАДН и НАДФН-оксидазы, так как оба фермента активируются ангиотензином.

АФК в качестве вторичных мессенджеров участвует регуляции обмена Са2+, стимуляции фосфолирирования белков и активации факторов транскрипции.

В присутствии оксидантов увеличивается транспорт Са2+ через кальциевые-каналы и ингибируется АТФ-зависимый Са2+-насос.

Оксиданты, увеличивая активность различных

протеинкиназ, участвуют в регуляции многочисленных клеточных процессов, таких как митогенез, клеточная адгезия, апоптоз и т.д.

Также звеном действия оксидантов в качестве вторичных мессенджеров является фосфолипаза А2. Её активация оксидантами сопряжена с вовлечением многих путей передачи сигнала. Арахидоновая кислота, как продукт фосфолипазы А2 , является важным медиатором таких процессов как воспаление, иммунные процессы, НАДФН-оксидазная активность, свертывание крови.

Таким образом выделяют 3 возможных пути действия оксидантов в качестве вторичных мессенджеров на процессы в клетке, связанные с образованием сигнальных молекул:

Влияние на структуру клеточных мембран.

Влияние на состояние депо Са2+, что сопровождается его мобилизацией из депо и поступлением в цитозоль.

Активация фосфолипазы А2 .

1.3 Физиологическая роль свободнорадикального окисления

Любой радикал является индуктором свободнорадикальных реакций. Процессы свободнорадикального окисления (СРО) с участием АФК при достаточно низкой интенсивности относятся к нормальным метаболическим процессам. Радикалы кислорода индуцируют процессы ПОЛ, необходимые для процессов обновления фосфолипидов и регуляции проницаемости клеточных мембран. Важной физиологической функцией АФК является активация ряда мембранных белков и иммуноглобулинов, а также ферментов, регулирующих переключение метаболических путей и синтез макроэргических соединений в клетке. С процессами СРО непосредственно связаны окислительное фосфорилирование и скорость клеточного деления. Перекись водорода может выступать в качестве метаболического сигнала для внутриклеточных процессов, приводящих к окислению специфических SH-групп протеинкиназ. Будучи активированными, эти белки транслоцируются в ядро и индуцируют экспрессию групп генов, продукты экспрессии которых ответственны за различные формы защитных реакций клетки. Кроме этого, перекись обладает инсулиноподобным действием.

Продукты свободно-радикальных реакций и ПОЛ участвуют в биосинтезе прогестерона, стероидных и тиреоидных гормонов, лейкотриенов, тромбоксана А2, протромбина. Важным свойством активных метаболитов кислорода и, в частности, супероксиданион-радикала, является регуляция метаболизма соединительной ткани. АФК стимулируют пролиферацию фибробластов, синтез и распад коллагена и триптофана, участвуют в метаболизме железа. Некоторые из оксигеназ, а именно группа ферментов, получивших наименование цитохрома Р-450 (в настоящее время насчитывается более сотни изоформ), помимо гидроксилирования эндогенных соединений, используют кислород и ряд АФК для детоксикации липофильных ксенобиотиков. Цитохром Р-450 зависимые монооксигеназы и сопряженная с ними электронно-транспортная система осуществляют внедрение АФК непосредственно в молекулу субстрата, что приводит к образованию окисленного, более гидрофильного продукта. В организме цитохром Р-450-зависимые монооксигеназы выполняют ряд важнейших функций. Во-первых, это окислительная биотрансформация (биосинтез или деградация) эндогенных липофильных молекул-эндобиотиков (стероидов, ретиноидов, метаболитов арахидоновой кислоты), во-вторых, биотрансформация поступающих извне химических соединений-ксенобиотиков, которые не являются участниками нормальных биохимических процессов в клетке и подлежат удалению. Основная монооксигеназная реакция всегда сопровождается образованием супероксиданион-радикала, перекиси водорода, а иногда и активных метаболитов окисляемого субстрата. Преимущественно эти ферменты представлены в эндоплазматическом ретикулуме клеток, максимально ферментная система экспрессирована в гепатоцитах, надпочечниках и половых железах .

АФК участвуют в регуляции сосудистого тонуса путем ингибирования эндогенного оксида азота. Одна из радикальных форм кислорода - пероксинитрил, легко превращающаяся в исходные продукты - оксид азота и супероксиданион-радикал, является транспортной формой для N0˙, в результате чего радиус действия этой сигнальной молекулы может значительно увеличиваться. Свободнорадикальная природа пероксинитрила является причиной ослабления и нивелирования многочисленных физиологических эффектов оксида азота. Взаимодействие же закиси азота и супероксиданион-радикала сопровождается резким усилением окислительного потенциала последнего.

Метаболиты кислорода участвуют в рекциях клеточного и гуморального иммунитета как регуляторы и эффекторы этих процессов. В частности, радикалы кислорода, генерируемые оксидазами нейтрофильных гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов, играют одну из основных ролей в реализации микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия этих клеток. При этом основными эффекторами микробицидного действия являются гидроксильный радикал, перекись водорода и гипогалоиды.

АФК стимулируют пролиферацию иммунокомпетентных клеток. Доказано прямое участие супероксиданион-радикала в образовании хемотаксических факторов, вызывающих активацию и миграцию лейкоцитов в очаг воспаления. Способностью вызывать синтез хемотаксических пептидов обладает и гидроксильный радикал, который одновременно с этим усиливает митогенстимулированную пролиферацию и последующую дифференцировку лимфоцитов.

Многие важные процессы, такие как генерация конечных продуктов пуринового обмена и распад дофамина, сопровождаются выработкой АФК.

Адренэргическая стимуляция физиологически приводит к усилению, а холинэргическая - к ослаблению продукции эндогенных АФК, противоположно изменяет редокс-потенциал клетки и создает условия для пермессивного эффекта, когда один и тоже сигнал вызывает различный ответ клеток, в зависимости от их редокс-состояния. Так, например, ФНО вызывает либо гибель клеток, либо их пролиферацию, т.к. зависимый от него фактор транскрипции срабатывает только при сдвиге окислительного потенциала клеток - мишеней.

Осуществляя защитные реакции, клетки (макрофаги и гистиоциты) могут многократно усиливать продукцию АФК. При фагоцитозе происходит ″метаболический взрыв″ в фагоцитах, т.е. многократное усиление потребления энергии фагоцитирующей клеткой. Значительная часть этой энергии расходуется НАДФН - зависимыми оксидазами на образование супероксидного радикала.

АФК осуществляют бактерицидный эффект в фаголизосомах, т.к. в отличие от лизосомальных гидролаз, АФК способны разрушать неповрежденные клеточные стенки бактерий и интактные мембраны клеток, кислородзависимый механизм завершающей стадии фагоцитоза более важен чем гидролитический.

АФК также секретируется вовне в процессе экзацитоза, в расчете на их способность разрушать причинный агент первичной альтерации, путем перекисного окисления мембран соседних клеток, осуществляют вторичное самоповреждение и способствуют выработке эйкозанойдных медиаторов воспаления .

1.4 Регуляция свободно-радикального окисления

Скорость СРО и содержание свободных радикалов в организме в норме поддерживается на определенном уровне сложной, многоступенчатой системой регуляции. В ней можно условно выделить специфические и неспецифические факторы, значение и вклад которых меняется на различных стадиях окисления.

Неспецифические факторы:

механизмы, регулирующие количество и качество субстрата окисления и его доступность;

факторы, влияющие на инициаторы окисления, в частности, на состояние металлов переменной валентности;

физико-химические свойства биологических мембран;

механизмы, поддерживающие низкое содержание O2 в тканях.

Специфические механизмы:

ферменты, ответственные за образование и метаболизм АФК (СОД, каталаза и др.);

системы, утилизирующие перекисные продукты (глутатион-пероксидаза, глутатион-редуктаза и др.);

перехватчики АФК (метионин, гистамин и др.);

биоантиоксиданты (токоферол, убихинон, церулоплазмин).

1.5 Система антиоксидантной защиты организма

Исходя из свойств радикальных производных молекулярного кислорода и органических перекисей, защита организма от их пагубного воздействия является одной из важнейших задач по поддержанию гомеостаза. Систему защиты тканей и клеток от токсических метаболитов кислорода и продуктов ПОЛ можно условно разделить на физиологическую (механизмы, осуществляющие регуляцию доставки и поступления кислорода к клеткам) и биохимическую (собственно антиоксидантную систему организма, т. е. широкий класс химических соединений, снижающих активность радикальных окислительных процессов). Физиологический компонент системы АО защиты организма обеспечивает равновесие между интенсивностью транспорта кислорода к клеткам и метаболическими процессами по его выгодной и безопасной утилизации. Эти механизмы ограничения свободнорадикальных реакций обеспечиваются за счет:

наличия каскада уровней парциального давления кислорода, понижающегося от альвеол к клеткам с 100-105 до 8-10 мм.рт. ст., то есть в 10-13 раз.

снижения напряжения кислорода в некоторых субклеточных структурах в 100-1000 раз по сравнению с парциальным давлением кислорода в капиллярах. Процесс опосредован относительно большой межкапиллярной дистанцией и высоким сродством цитохромоксидазы к кислороду;

редукции микроциркуляции в тканях при увеличении парциального давления кислорода в артериальной крови. Происходящий при этом так называемый «гипероксический вазоспазм» имеет несколько причин. Существенное значение придается снятию сосудорасширяющего действия СО, а также снижению активности NO-синтаз и, соответственно, снижении выработки основного фактора расширения сосудов - оксида азота. Признается также и возможность прямого сосудосуживающего действия кислорода .

Биохимическую АО-систему организма условно можно разделить на специфическую и неспецифическую. Специфическая АО-система направлена на разрушение АФК и продуктов их дальнейших превращений. Действие неспецифической АО-системы связано с предотвращением условий и возможностей утечки электронов и генерации АФК в ходе окислительно-восстановительных реакций (в рамках окислительного фосфорилирования) или в процессе аутоокисления субстратов (микросомальное окисление).

Патогенному воздействию ПОЛ противостоят специализированные ферментные системы и целый ряд неферментных соединений. К специфическим АО-энзимам можно отнести супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы. Эта группа ферментов локализующихся преимущественно внутриклеточно, обладает способностью разрушать свободные радикалы, а также участвовать в разложении гидроперекисей нерадикальным путем. Энзимы антирадикальной защиты характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных радикалов; специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве стабилизаторов металлов, к которым относятся медь, цинк, марганец, железо и ряд других.

ОксидантыАнтиоксидантыАктивные формы кислорода: О˙2 - супероксидный анион радикал; ¹O2 - синглетная форма кислорода; OH˙ - гидроксильный радикал; Н2О2 - перекись водорода; Окисленные галогены: CLO˙ - гипохлорид, хлорамины; Окислы азота: NO˙ - оксид азота; Свободные радикалы образующиеся при перекисном окислении липидов: RO˙, RO2˙- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот[.Ферментные Супероксиддисмутазы Каталаза Глутатион (GSH-)-пероксидазы GSSG-редуктазы Глутатион- S-трансферазы УДФ-глюкуронилтрансферазы НАДФ- Н-хиноноксидоредуктаза НАДФ- Н-хиноноксидоредуктаза Неферментные Глутатион а-Токоферол (витамин Е) β-Каротин Ураты Билирубин Флавоноиды Альбумин Церулоплазмин ТрансферринТаблица 1.Сводная таблица оксидантов и антиоксидантов.

Содержание АО-ферментов в различных тканях организма существенно различается. Так, их уровень и активность в клетках соединительной ткани в несколько раз ниже, чем в паренхиматозных органах. Уровень ферментативных АО в клетках находится под генетическим контролем. Так, повышение содержания супероксиданион-радикала или перекиси водорода в цитозоле клеток сопровождается активацией транскрипции генов, запускающих синтез около 40 белков, среди которых - каталаза, супероксиддисмутаза, гидропероксидаза, а также эндонуклеаза репарации ДНК. Практически все воздействия, приводящие к усилению образования АФК в клетках, индуцируют синтез ферментативных АО.

В условиях гипоксии и гипероксии, т. е. состояний, усиливающих образование АФК, повышается уровень ферментных АО внутри клеток. В нормальных условиях содержание ферментных АО относительно постоянно и мало зависит от пола, отмечается некоторое снижение их уровня с возрастом. В то же время нормальное функционирование АО-системы организма и содержание ферментных АО резко нарушается при критических состояниях (ранениях, травмах, а также обширных ожогах кожи. Тяжелые травмы сопровождаются нарушением динамического равновесия прооксидантных и антиоксидантных систем, при этом содержание и активность эндогенных антиоксидантов, в том числе и АО-энзимов, резко снижается внутри и вне клеток .

Как уже отмечалось, ключевым ферментом АО-защиты является супероксиддисмутаза (СОД), открытая McCord J. и Fridovich I. в 1969 г. СОД относится к классу окислительно-восстановительных ферментов и присутствует в значительных количествах практически во всех про- и эукариотических клетках. В организме человека СОД обнаружена во всех органах и тканях, причем особенно высока внутриклеточная концентрация.

В крови фермент находится в следовых концентрациях, при экзогенном введении чрезвычайно быстро, в течение 5-10 минут выводится в неизмененном виде почками. Высокая концентрации СОД, сравнимая с внутриклеточной, отмечается в бронхоальвеолярной жидкости. Во внеклеточном пространстве фермент присутствует в очень малых количествах. Следствием этого в случае образования большого количества супероксиданион-радикалов во внеклеточном пространстве, например, в очаге воспаления, организм оказывается практически беззащитным перед повреждающим воздействием радикалов.

Основной функцией СОД является ускорение реакции дисмутации супероксидных радикалов, образующихся в ходе биологического окисления. Скорость спонтанной реакции при нейтральных значениях рН не превышает 7 х 105 Мˉ1 сˉ1, в присутствии СОД она возрастает до 2 х 109 Мˉ1 сˉ1 и выше, т. е. фермент ускоряет реакцию на три-четыре порядка.

СОД имеет несколько изоформ, различающихся строением активного центра. Железосодержащий изофермент характерен только для микроорганизмов, для клеток человека характерны две его другие разновидности. Марганецсодержащий фермент (Mn-СОД) локализован в митохондриях, цианидрезистентен. В общем объеме супероксиддисмутазной активности доля Mn-СОД невелика и составляет около 15%. До 40% СОД, сконцентрированной в ядрах клеток, приходится именно на марганцевую форму фермента, которая дисмутирует до 20% супероксидных радикалов, продуцирующихся в ядре клетки. Медь-цинковая форма энзима (Си, Zn-СОД), чувствительная к цианиду, содержится в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий. Считается, что атом меди обеспечивает каталитическую активность, а атом цинка - стабилизацию структуры цитозольной изоформы фермента. Низкомолекулярые тиолы за счет восстановления иона Си2+, присутствующего в активном центре СОД, активируют энзим и ускоряют дисмутацию кислорода.

В большинстве случаев фермент состоит из двух одинаковых субъединиц (молекулярный вес колеблется в пределах 30-40 кДа), каждая из которых содержит каталитически активный ион меди и ион цинка, связанные общим лигандом - имидазолом гистидина 61.

Важнейшая роль СОД для клеточного метаболизма предопределена не только широким распространением этого фермента, но и рядом его уникальных свойств: высокой термоустойчивостью, устойчивостью к действию протеаз, денатурирующих агентов, широким оптимумом рН каталитической активности. Фермент довольно устойчив в растворах - выдерживает нагревание до 100° С в течение минуты, не теряет активности в диапазоне рН от 2 до 12.

Каталаза представляет собой гемсодержащий фермент с молекулярной массой 250 кДа. Также как и СОД, каталаза представлена во всех клетках организма, однако ее уровень в различных тканях неодинаков. Высокое содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, почках и печени. В пероксисомах последних фермент составляет до 40 % всего белка. Реакция, катализируемая каталазой, в общем виде выглядит следующим образом.

Скорость катализа исключительно велика: одна молекула каталазы в секунду разлагает до 44 000 молекул перекиси водорода. Активность каталазы зависит от соотношения числа дисульфидных связей к количеству сульфгидрильных групп в молекуле фермента, которые участвуют в образовании ее активного центра. Из-за этого каталаза чувствительна к действию тиоловых ядов. Из-за большого молекулярного веса молекулы энзим практически не проникает через клеточные мембраны. Это является некоторым препятствием для использования препаратов каталазы в практике.

АО-ферменты СОД и каталаза, функционируя совместно, своевременно инактивируют АФК, супероксиданион-радикал и перекись водорода, образующихся в процессе нормального метаболизма клеток, а также при значительной интенсификации процессов ПОЛ. Однако данные ферменты обладают слабой активностью по отношению к липидным пероксидам, образующимся в ходе цепных реакций ПОЛ. Разрушение этих продуктов осуществляется с участием ферментной системы глутатиона.

Система ферментов глутатиона. Селенсодержащая глутатионпероксидаза способна эффективно разлагать гидроперекиси липидов и перекись водорода. Ее сродство к перекиси водорода выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях перекиси, в то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями перекиси водорода, ключевая роль принадлежит каталазе. Глутатионпероксидаза катализирует реакцию окисления глутатиона с образованием его конъюгированной формы, в ходе реакции перекись водорода разлагается до воды.

2G-SH + Н2О2 → G-S-S-G + 2Н2О

Фермент также катализирует реакцию восстановленного глутатиона с гидроперекисями липидов, при этом последние превращаются в жирные оксикислоты:

2G-SH + ROOH → G-S-S-G + R-OH+ Н2О

Наряду с этим, глутатионпероксидаза способна восстанавливать перекиси белкового и нуклеиновокислотного происхождения. Глутатионпероксидаза локализована в цитозоле (около 70 %) и митохондриях (20-30 %) всех клеток млекопитающих. Активный центр фермента содержит четыре атома селена, ковалентно связанных в форме селеноцистеина. Недостаток селена в рационе питания сопровождается снижением активности глутатионпероксидазы в клетках и, соответственно, пониженной устойчивостью организма к окислительному повреждению. В тяжелых случаях это может приводить к развитию аналогичной авитаминозу Е свободнорадикальной патологии, для которой характерны ожирение, некробиотические изменения в печени и гемолиз эритроцитов (болезнь Кешана).

Еще одним ферментом, использующим глутатион для осуществления АО-защиты, является глутатионтрансфераза. Глутатионтрансфераза содержится преимущественно в цитозоле клеток, в печени человека она составляет 2-4 % от общего количества цитозольного белка. Фермент, а точнее, группа ферментов, осуществляет конъюгацию восстановленного глутатиона с гидрофобными соединениями и восстановление органических перекисей. Элиминация производных липофильных ксенобиотиков, а также продуктов ПОЛ, в том числе гидроперекисей жирных кислот, осуществляется посредством их восстановления, нуклеофильного замещения или присоединения к молекуле глутатиона:

ROOH + 2G - SH → ROH +G - S - S - G + H 2О+G - SH →R- S - G + XH+ G - SH → HR - SG

В отличие от глутатионпероксидазы, для которой лучшими субстратами являются гидрофильные гидропероксиды с малым размером молекулы, глутатионтрансфераза не взаимодействует с перекисью водорода, а восстанавливает гидрофобные гидропероксиды с большим объемом молекулы: гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот - линоленовой и арахидоновой, а также фосфолипидов. Кроме этого, фермент восстанавливает гидроперекиси мононуклеотидов и ДНК, участвуя тем самым в их репарации. Глутатионтрансфераза - важный компонент АО-защиты, обеспечивающий удаление многих метаболитов окислительного стресса. Восстановленный глутатион необходим для нормальной работы глутатионзависимых ферментов. Поддержание его достаточного уровня осуществляется посредством синтеза, за счет его десорбции из связей с белками или же путем восстановления из окислений формы. Эта реакция осуществляется ферментом глутатионредуктазой, относящейся к флавопротеинам.

G-S-S-G + НАДФН + Н+ → 2G - SH + НАДФ +

Глутатионредуктазная система позволяет быстро пополнять пул восстановленного глутатиона в тканях. Основным источником НАДФН для этой реакции служит пентозный цикл окисления глюкозы, при этом НАДФ-зависимые дегидрогеназы пентозного цикла активируются окисленным глутатионом.

Снижение содержания восстановленного глутатиона в тканях создает благоприятные условия для блокирования SH-групп, входящих в состав ферментов и структурных белков клетки. Считается, что глутатион является основным агентом, защищающим тиоловые ферменты от окисления. К числу тиоловых ферментов относятся многие оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы и лигазы. Окисление SH-групп нарушает функционирование глкюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, АТФ-азы, моноаминоксидазы, ксантиноксидазы, глутатионредуктазы и каталазы. Приведенные факты подтверждают мнения о том, что тиоловые соединения принимают самое непосредственное и широкое участие в механизме функционирования ферментативного звена АО-системы, выполняя не только антирадикальное, но и антиперекисное действие.

Водорастворимые низкомолекулярные тиоловые соединения: глутатион и эрготионеин. Первый из них является компонентом небелковой тиолдисульфидной окислительно-восстановительной системы и представляет собой трипептид, образованный аминокислотами цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Глутатион существует и двух формах - восстановленной (до 97% от общего количества) и окисленной. Наряду с другими серосодержащими соединениями, глутатион является ингибитором АФК и стабилизирует клеточные мембраны. Ему принадлежит ведущая роль в нейтрализации гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона или в результате ридиолиза воды под действием ионизирующих излучений .

1.6 Патогенетические механизмы нарушений, развивающиеся при нарушении баланса антиоксидантной и прооксидантной систем

Нарушение сбалансированности антиоксидантной (АОС) и прооксидантной систем (ПОС) обусловливает развитие окислительного стресса (ОС). Токсическое действие АФК проявляется при состояниях ОС, который сопровождается резкой интенсификацией свободно-радикальных процессов в тканях. Это является важнейшим патогенетическим звеном развития многих воспалительных процессов, радиационных поражений, сердечно-сосудистых, онкозаболеваний, химических и других интоксикаций. Механизм генерации АФК при многих патологических состояниях носит общий характер. Некоторые отличительные особенности можно выявить только на начальных стадиях. Так, при воспалительных процессах пусковым фактором интенсификации свободнорадикальных процессов является дыхательный взрыв, при гипоксии - нарушение в первую очередь системы тканевого дыхания, при химических поражениях - активация системы микросомального окисления. Таким образом, причины, вызывающие интенсификацию свободно-радикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекулярном уровне носят однотипный характер и процессы генерации АФК взаимосвязаны. Некоторые антиоксиданты в условиях ОС могут выступать в качестве прооксидантов. При состояниях ОС возрастает восстановительный потенциал клетки за счет субстратов, коферментов в восстановленном состоянии, что приводит к снижению рН в очагах ишемии тканей сердца и головного мозга. Это создает условия для повышения пула "активных форм" металлов переменной валентности. В условиях повышеной генерации АФК они могут участвовать в реакциях, связанных с генерацией радикальных продуктов. Так, в присутствии Fe/Cu и О2 тиолы (RSH) являются источниками радикалов, RS, О2-, Н2О2 и ОН, НАДФН-радикалов НАД(Ф), аскорбиновая кислота - семидегидраскорбат радикала . Повышение уровня АФК сопряжено с интенсификацией процессов окислительной деструкции липидов, белков, нуклеиновых кислот, углеводов. Именно интенсификация этих процессов является основной причиной цитотоксического поражения тканей.

Как уже указывалось, причиной накопления активных форм кислорода являются нарушения нормального окислительного метаболизма клеток при патологии (шунтирование кислородом электротранспортных путей в митохондриях и в системе макросомального окисления при «утечке» электронов, трансформация дегидрогеназных путей в оксидазные, реакции аутоокисления, например, катехоламинов и пр.).

В концентрациях, превышающих физиологические, все эти соединения являются высокотоксичными для биологических систем всех уровней, от молекулярно-клеточного до организменного. Свойство осуществлять окислительное повреждение и деструкцию компонентов живых систем, обусловленное активными производными кислорода, получило обозначение как «токсичность кислорода».

Свободные радикалы кислорода являются нестойкими химическими соединениями и легко вступают в реакции с биомолекулами, вызывая их модификацию или деструкцию. Объектами неспецифических несанкционированных окислительных реакций с участием кислорода и его химически активных производных могут служить молекулы различной химической природы. АФК способны разрывать любую углеводородную связь и легко разрушают высокомолекулярные соединения: гиалуроновую кислоту, протеогликаны, коллаген, иммуноглобулины. В присутствии ионов двухвалентного железа АФК превращают оксигемоглобин в метгемоглобин. Окисление функциональных групп биологически активных веществ является причиной деградации структурных белков и липидов клеточных мембран и нуклеиновых кислот, ингибирования ферментов, изменения структуры и свойств гормонов и их рецепторов.

Результатом взаимодействия активных производных кислорода с молекулой ДНК является структурная модификация азотистых оснований, разложение пятичленного кольца дезоксирибозы, а также расщепление сахарофосфатного остова, что в конечном итоге приводит к фрагментации этого полимера. Доказано, что избыточная выработка АФК, в частности, супероксиданион-радикала, синглетного кислорода и гидроксильного радикала, может явиться причиной ряда хромосомных аббераций и мутаций ряда генов в лимфоцитах человека. Взаимодействие АФК с белками приводит к структурным изменениям этого типа биомолекул, заключающимся в модификации боковых группировок аминокислотных остатков, фрагментации полипептидных цепей и образованию ковалентных связей внутри молекул и между ними. Толерантность белков к АФК зависит от их аминокислотного состава, к свободнорадикальному повреждению более чувствительны циклические и серосодержащие аминокислоты. Из 20 незаменимых аминокислот наиболее уязвимыми для АФК, в частности для синглетного кислорода, являются гистидин, триптофан, метионин, тирозин и цистеин. Отличительной особенностью окислительного повреждения липидов в составе клеточных мембран является то, что в гидрофобной области их жирнокислотных остатков способен аккумулироваться молекулярный кислород. В результате этого, а также тесного и параллельного расположения по отношению друг к другу соседних жирнокислотных остатков создаются условия для развития окислительных повреждений по типу цепных реакций. Из-за ключевой роли в такой экспансии органических гидроперекисей этот процесс получил наименование перекисного окисления липидов .

2. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

Основными субстратами ПОЛ являются полиненасыщенные высшие жирные кислоты (ВЖК), находящиеся в структуре фосфолипидов мембран. На разных стадиях пероксидации ВЖК образуются диеновые и триеновые конъюгаты, пероксиды БЖК (R-ОО˙), гидроперекиси ВЖК (R-ООН), эндоперекиси, малоновый диальдегид и новые свободные радикалы. Сильнейшим катализатором процесса являются ионы металлов (Fe2+). Процесс может оборваться при образовании продуктов, не содержащих свободных радикалов.

Процессы ПОЛ можно условно подразделить на три последовательных этапа, или фазы развития: процессы зарождения цепей, процессы развития цепных реакций и обрыв цепей. На стадии зарождения цепей под действием свободных радикалов кислорода, ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических веществ, относящихся к прооксидантам, происходит образование органических радикалов (R).

О2 + R-H→R˙ + НО2

ОН˙ + R-H → R˙ +Н2О

На следующей стадии радикал быстро взаимодействует с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате происходит образование пероксирадикала (RO2), который атакует ненасыщенные липиды. Возникновение в результате этой реакции органических перекисей и нового радикала (R) способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер:

R + О2 → RO2;+ RH → ROOH + R

Органические перекиси (ROOH) включаются в процесс генерации радикалов, в присутствии металлов переменной валентности (меди, кобальта, марганца, железа) происходит образование реакционного алкоксильного радикала:

ROOH + Me n+→RO + ОН ˉ + Me (n+1)-

Часть образующихся органических радикалов взаимодействует друг с другом, при этом происходит образование неактивных молекул, что обрывает ход реакций свободнорадикального окисления:

RO2 + R → ROOR

Гидроперекиси липидов способны подвергаться нерадикальным - окислительным превращениям, что приводит к образованию первичных (диеновые коньюгаты, диальдегиды), промежуточных (основания Шиффа) и конечных продуктов ПОЛ, а также спиртов, кетонов и альдегидов. Обрыв цепных реакций перекисного окисления возможен при взаимодействии радикалов со специализированными ферментными системами, а также с рядом низкомолекулярных веществ, совокупно формирующих биохимический компонент антиоксидантной системы организма

Избыточная активация ПОЛ может возникать как следствие резких изменений кислородного режима клетки. При этом гипероксия является причиной временного усиления процессов ПОЛ, а стойкая гипоксия ведет к лавинообразному накоплению токсичных продуктов перекисного окисления. Чрезмерная интенсивность реакций ПОЛ развивается под действием внешних воздействий, к которым можно отнести ионизирующее и ультрафиолетовое облучение, а также ряд химических веществ, относящихся к прооксидантам. Продукция АФК и, соответственно, интенсивность процессов ПОЛ в клетках резко возрастают как неспецифическая реакция при действии на организм различных стрессорных факторов химической, физической и биологической природы. В конечном итоге все эти воздействия могут приводить к напряжению и последующей декомпенсации механизмов антиоксидантной защиты организма и развитию окислительного стресса, проявляющегося на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Типовые патологические процессы, такие как гипоксия и воспаление, свойственные и развивающиеся при большинстве соматических и инфекционных заболеваний, тяжелых травмах и ранениях, всегда сопровождаются избыточным образованием АФК и продуктов ПОЛ

Длительная активация процессов ПОЛ сопровождается развитием синдрома липидной пероксидации. При чрезмерной активации ПОЛ, когда, значительная часть мембранных фосфолипидов подвергается окислительной деградации, липидная фаза мембран становится более ригидной. Это ограничивает конформационную подвижность полипептидной цепи, вследствие чего снижается функциональная активность ферментов, рецепторов и каналообразующих белков, встроенных в мембраны, что в свою очередь препятствует удалению Са+2 из саркоплазмы и обеспечивает повреждающее действие кальция на клеточные органеллы. К настоящему времени доказана способность метаболитов ПОЛ ингибировать К+/Na+-АТФазу плазматической мембраны, вызывать цитолиз гепатоцитов с развитием ферментемии. Продукты ПОЛ нарушают нормальное функционирование кальциевых каналов L-типа, что сопровождается электролитными нарушениями в клетках миокарда. Их избыток приводит к сдвигу метаболизма арахидоновой кислоты, в результате чего одно из образующихся соединений (15-гидроарахидоновая кислота) снижает β-адренергическую стимуляцию за счет угнетения этого типа адренорецепторов. Продукты этих реакций повреждают мембраны эритроцитов, окислят альбумин сыворотки, нарушают синтез нуклеиновых кислот в клетках.

Активированные формы кислорода и продукты ПОЛ повреждают гиалуроновую кислоту, протеогликаны, коллаген, иммуноглобулины. Некомпенсированная антиоксидантной системой генерация активированных форм кислорода может вызвать повреждающее действие на эндотелий и базальную мембрану сосудов непосредственно или опосредованно через инактивацию антиоксидантных систем. Морфологически выявляемые гранулы липофусцина, состоящие из отложений нерастворимых липоперекисей и белков, являются продуктами ПОЛ.

АФК и продукты ПОЛ способствует избыточной выработке и высвобождению ряда провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухолей, интерлейкина-1, интерлейкина-6) и медиаторов воспаления (гистамина, брадикинина, серотонина), производных арахидоновой кислоты - лейкотриенов, простагландинов и тромбоксанов. Избыточная выработка АФК и продуктов ПОЛ обусловливает резкую активацию системы комплемента по альтернативному пути с высвобождением анафилатоксина .

2.1 Участие АФК и продуктов ПОЛ в патогенезе заболеваний человека

Для большинства или почти всех патологичгских состояний, течение которых сопровождается участием АФК, присуще так называемое состояние окислительного стресса, характеризующееся интенсификацией продукции этих субстанций. Следует отметить, что состояние окислительного стресса является характерным не только для заболеваний, но имеет место и при физиологическихсостояниях, близких к экстремальным - интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, а также при старении организма. Существует «свободнорадикальная теория старения», ее создатель Д. Хармен, впервые изложивший основные положения теории в 1955 г. Теория Хармана базируется на системе аргументаций, связанной со способностью свободных радикалов неспецифически повреждать такие макромолекулы, как ДНК, липиды и белки, а процесс старения связывается с накоплением таких повреждений в организме. В рамках этой теории находит объяснение не только старение ррганизма, но и широкий круг связанных со старением патологических процессов: сердечнососудистые заболевания, возрастные дисфункции мозга, иммунодепрессия, канцерогенез и другие виды патологии.

При всех заболеваниях, где в качестве обязательного компонента присутствует воспалительная реакция, ведущую роль в повреждении клеток и тканей организма выполняют АФК, продуцируемые лейкоцитами, главном образом, нертрофилами. Хотя наиболее разрушительные формы АФК, генерируемые миелопероксидазой, действуют в фаголизосомах лейкоцита, однако в очаге воспаления нейтрофилы способны секретировать этот фермент и во внеклеточное пространство. Уничтожение инфекционного агента при развитии воспалительного процесса может обеспечиваться и ценой попутного повреждения собственных тканей в очаге воспаления, при этом кислородзависимое повреждение тканей носит как прямой, так и опосредованный характер. Последний реализуется при воздействии АФК на регуляторные и эффекторные молекулы, например, на протеиназы и ингибиторы протеиназ. АФК могут прямо активировать латентные формы коллагеназы секретируемые нейтрофилами, а также инактивировать универсальный ингибитор протеиназ - α2-макроглобулин и специфический ингибитор сериновых протеиназ - αı-антитрипсин. АФК, генерируемые внутриклеточно, а также проникающие внутрь через клеточную мембрану, являются пусковыми факторами индукции апоптоза.

Свободнорадикальный механизм повреждения плазматических, митохондриальных и ядерных мембран, ядерного и митохондриального генома, липопротеинов крови приводит к повреждению сосудов и гистогематических барьеров, что играет важнейшую, нередко решающую роль в патогенезе наиболее распространенных заболеваний воспалительной, токсической и аутоиммунной природы.

Патогенетическая роль АФК выявлена к настоящему времени приблизительно для сотни заболеваний человека. Это имеет место при сердечно-сосудистой патологии - ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, острой артериальной непроходимости сегмента конечности, ишемических и реперфузионных поражениях почек, головного мозга и других тканей, в развитии катаракты и атеросклероза. Показано, что формирование атеросклеротических бляшек в интиме сосудов происходит при активном участии свободных радикалов, взаимодействующих с полиненасыщенными жирными кислотами. В основе патогенеза системной красной волчанки лежит повышенная чувствительность нуклеиновых кислот (в частности, ядерного ДНК) к повреждающему действию свободных радикалов. Предрасполагающим фактором заболевания является диета с избыточным количеством полиненасыщенных жирных кислот.

АФК играют важную роль при бронхолегочной патологии, как при острых, так и при хронических заболеваниях (например, эмфиземе, астме и хроническом бронхите). Чрезвычайно важное значение свободные радикалы имеют в патогенезе респираторного дистресс-синдрома. Именно АФК, вырабатываемые нейтрофилами крови, отводится ведущая роль в повреждении эндотелиально-альвеолярного барьера, развитии интерстициального отека и развернутой клиники этого синдрома. Чрезмерная и длительная стимуляция ферментных систем, отвечающих за генерацию активных радикалов фагоцитов, лежит в основе механизмов формирования профессиональной пылевой болезни и таких ее осложнений, как системный коллагеноз и злокачественное перерождение клеточных элементов легких и плевры. Многолетнее ретроспективное исследование, проведенное в 23 странах под эгидой ВОЗ, выявило прямую зависимость частоты развития некоторых видов злокачественных новообразований легких, молочной железы, яичников и прямой кишки от количества потребляемых животных жиров и интенсивности процессов ПОЛ в организме .

Многочисленные исследования свидетельствуют, что процессы свободнорадикального окисления лежат в основе патогенеза многих хронических заболеваний печени, причем избыточное образование АФК и продуктов ПОЛ проявляется на самых ранних стадиях процесса. Гепатотоксическое действие радикалов кислорода проявляется на мембранах клеток, являющихся основным местом синтеза супероксиданион-радикала. Усиление продукции АФК в результате индукции ксантиноксидазы интерфероном происходит даже при вирусном поражении. Радикалы кислорода повреждают мембранный аппарат гепатоцита, разрушают липидный слой его мембран, а также повреждают белки - ферменты монооксигеназной системы. Тяжесть течения и прогноз развития хронического заболевания печени тесно связаны с функциональным состоянием антиоксидантной системы гепатоцитов.

Избыточная активация ПОЛ является причиной возникновения и прогрессирования гипертонической болезни. Установлено, что под влиянием АФК и продуктов ПОЛ нарушаются проницаемость клеточных мембран и активность Na+/K+-АТФазы, что приводит к накоплению в клетках ионизированного кальция. Кроме этого, вторичные продукты ПОЛ способны прямо воздействовать на тонус артериальных сосудов. Кроме сосудосуживающего действия, радикалы кислорода активируют работу фибробластов соединительной ткани, в результате чего развивается артериокапиллярный фиброз, т. е. необратимые изменения сосудов. Окислительный стресс практически всегда развивается при инфекционных заболеваниях. Избыточное образование свободных радикалов кислорода является одним из ведущих механизмов в патогенезе гриппа. Генерирование АФК определяет мутагенез и протеолитическую активность вируса гриппа, цитопатический эффект вирусной инфекции, деструкцию капиллярной сети и стенок капилляров, развитие сливных пневмоний и отека легких.

Токсическое повреждение нейронов АФК, продуктами ПОЛ и окислительный стресс рассматриваются в качестве ведущего механизма при нейродегенеративных заболеваниях. Одной из причин развития рассеянного склероза могут быть митохондриальные нарушения, сопровождающиеся избыточной продукцией АФК. Активный кислород при рассеянном склерозе обладает непосредственно поражающим действием на ЦНС и является причинным фактором развития заболевания. Окислительное повреждение приводит к гибели нервных и глиальных клеток, что проявляется демиелинизацией и образованием очагов глиоза в ЦНС. В 37% случаев у людей с болезнью Паркинсона наблюдается дефектность первого комплекса дыхательной цепи в клетках черной субстанции. Постепенная кумуляция метаболитов кислорода, продуктов ПОЛ, металлопротеинов и развитие окислительного стресса в различных отделах ЦНС имеют особое значение при болезни Альцгеймера и хорее Гентингтона. Процессы накопления липофусцина в клетках ЦНС при этих состояниях соотносятся с уровнем антиоксидантных энзимов в мозговой ткани.

АФК и продукты ПОЛ оказывают прямое деструктивное действие на внутренние органы и приводят к развитию полиорганной недостаточности после тяжелых травм и обширных ожогов. Радиолиз воды, образование свободных радикалов кислорода и разнообразных метаболитов ПОЛ лежат в основе патогенеза острых и хронических радиационных поражений и человека .

2.2 Диагностика процессов перекисного окисления

Четких клинических признаков избыточной активации свободнорадикального окисления в организме человека нет. Развитие окислительного стресса у пациента сопровождается:

признаками дыхательной недостаточности и недостаточности

кровообращения (чаще имеет место гипердинамический тип кровообращения);

психомоторным возбуждением;

повышением температуры более 37,5° С;

выраженной болевой реакцией.

Лабораторными признаками окислительного стресса авторы считают:

повышение количества лейкоцитов в крови (> 10 тыс.) без палочкоядерного сдвига в ближайшее время после травмы (10-12 ч.);

увеличение содержания в крови аланиновой и аспарагиновой трансаминаз;

повышение концентрации глюкозы плазмы крови > 7,0 ммоль/л;

некомпенсированный метаболический ацидоз (рН < 7,2);

Для лабораторной диагностики выраженности окислительного стресса и определении показания для использования препаратов с антиоксидантными свойствами целесообразно оценивать состояние антиоксидантной системы, а также интенсивности свободнорадикальных реакций (процессов ПОЛ) в организме пациента. Оценка состояния антиоксидантной системы обычно включает в себя определение активности основных ферментных АО (активность СОД, каталазы и глутатионпероксидазы эритроцитов), а также содержание аскорбиновой кислоты, токоферола и селена в крови. Инструментальная оценка выраженности свободнорадикальных реакций предусматривает определение в пробах крови или тканей продуктов реакций перекисного окисления, к которым относят диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, основания Шиффа и активные формы кислорода. Совокупность этих показателей позволяет оценивать как состояние основных звеньев АО-системы организма, т. е. ее способность предотвращать избыточный ход реакций свободнорадикальной природы, так и фактическую интенсивность реакций ПОЛ и синтеза АФК. Исходя из этого, данные тесты могут рассматриваться в качестве лабораторных критериев диагностики окислительного стресса.

Лабораторная диагностика интенсивности ПОЛ необходима для суждения об АО-активности того или иного препарата, так как на основании клинических признаков невозможно адекватно оценить деиствие АО-препарата. Отметим, что использование только одного из указанных выше тестов не дает полной информации. Динамика показателей интенсивности свободнорадикальных реакций и содержание АО в организме порой имеют противоположную направленность. В ряде случаев колебания содержания продуктов свободнорадикальных реакций не сопровождаются изменением уровней активных форм кислорода, и наоборот. Резкая интенсификация свободнорадикальных реакций и накопление продуктов этих реакций в крови может не приводить к изменению содержания и активности основных компонентов АО-системы. Для достоверной и адекватной клинической интерпретации получаемых результатов принципиальное значение имеет не только абсолютная величина показателей, а их динамика на фоне проведения лечебных мероприятий.

Лабораторные критерии диагностики окислительного стресса

Оценка состояния антиоксидантной системы пациентаОпределение интенсивности свободнорадикальных реакцийСодержание и активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах или других, доступных для изучения клетках: Супероксиддисмутазы Каталазы ГлютатионпероксидазыСодержание в плазме (сывортке) крови первичных, вторичных и промежуточных продуктов перекисного окисления липидов: Диеновых коньюгат Малонового диальдегида Оснований ШиффаСодержание в крови низкомолекулярных антиоксидантов: Аскорбиновой кислоты Токоферола СеленаСодержание в крови активных (радикальных) форм кислорода: Супероксиданион-радикала Синглетного кислорода Общий уровень радикаловКаждый из предложенных показателей имеет свои достоинства и недостатки. Основными требованиями, предъявляемыми к лабораторным методам, являются точность, простота выполнения и хорошая воспроизводимость. Желательными являются простота подготовки проб к исследованию и возможность их хранения, что позволяет не проводить все тесты ex tempore. Наиболее широко распространенный в экспериментальных исследованиях и клинической практике метод определения малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой не является точным показателем, отражающим течение процессов ПОЛ, так как в ходе реакции тиобарбитуровая кислота взаимодействует с веществами нелипидной природы, имеющими в своем составе кето-группу, например, с глюкозой. Взаимодействие же тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом, исходно содержащимся в липидных системах, в количественном отношении играет незначительную роль. Тем не менее на протяжении почти тридцати лет метод является наиболее употребимым большинством исследователей при изучении процессов ПОЛ в различных биологических системах. К его достоинствам можно отнести простоту и относительную быстроту выполнения, а также хорошую воспроизводимость результатов. Другими распространенными методами оценки интенсивности реакций ПОЛ является определение уровня первичных и промежуточных продуктов этих реакций, т. е. диеновых конъюгатов и оснований Шиффа. Методы точны и относительно просты для воспроизведения. К их недостаткам относится невозможность хранения отобранных проб, поэтому исследования должны проводиться сразу или в пределах получаса после их отбора. Более точным и адекватным показателем интенсивности и выраженности свободнорадикальных реакций и, соответственно, состояния анти-оксидантной системы организма, является определение АФК - основных предшественников реакций ПОЛ; быстрое и точное измерение уровня которых в цельной крови осуществляется люминесцентным методом. В зависимости от вида используемого люминофора (люминол, люцигенин и т. д.) возможно определение как отдельных видов АФК, так и их общее количество. Метод отличается быстротой выполнения, его можно рекомендовать для экспресс-диагностики. Методика позволяет хранить пробы гепаринизированной крови для исследования до 12 ч при температуре +4˚С, т. е в обычном бытовом холодильнике.

Основные показатели, характеризующие оксидантно-антиоксидантную систему.

Интенсивность ПОЛ - оценивается по концентрации в крови и других биологических жидкостях промежуточных и конечных продуктов реакции.

Малоновый диальдегид (МДА) - конечный продукт ПОЛ.

Нормальная концентрация в крови - 2,5-6,0 мкМ/л. Зависит от метода определения, поэтому в каждой лаборатории имеется собственный референтный интервал.

Увеличение концентрации - свидетельство усиленного ПОЛ и срыва антиоксидантной защиты.

Определение малонового диальдегида в крови флуориметрическим методом (Федорова Т. Н., Коряцива Т. С, Ларский Э. Г.)

Принцип метода: тиобарбитуровая кислота (ТБК) в кислой среде взаимодействует с низкомолекулярными диальдегидами (главным образом с малоновым) с образованием окрашенного в розовый цвет комплекса.

Нормативные величины: 3,7±0,12 ед.

Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Коробейников Э. Н.)

Принцип метода: при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу гидроперекисей, разлагается с образованием малонового диальдегида, взаимодействие молекулы которого с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты приводит к формированию окрашенного комплекса.

Нормативные величины: 3,69±0,14нмоль/л.

Определение перекисей липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Гаврилов В. Б., Гаврилова А. Р., Мажуль Л. М.)

Принцип метода: тиобарбитуровая кислота реагирует с малоновым диальдегидом, который образуется при переокислении ненасыщенных жирных кислот, имеющих 2-3 диеновые связи, с образованием розового продукта, имеющего максимальное поглощение при 535 нм.

Нормативные величины: 100-120 нмоль/л.

Определение диеновых коньюгатов в плазме крови по УФ-поглощению

гептановых и изопропанольных экстрактов (Гаврилов В. Б.,

Гаврилова А. Р., Хмара Н. Ф.)

Принцип метода: метод основан на измерении интенсивности поглощения в области 223- 234 нм, обусловленной конъюгированными диеновыми структурами (предварительно экстрагированными из плазмы), возникающими при образовании гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот.

Спектрофотометрическое определение содержания ацилгидроперекисей (диеновых конъюгатов) в плазме (сыворотке) крови.

Принцип метода основывается на установлении содержания первичных продуктов ПОЛ в крови по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в ультрафиолетовой области спектра (233 нм).

Витамины с антиоксидантными свойствами.

Витамин А (ретинол) - жирорастворимый витамин, содержащийся в животных продуктах в форме А, и А2, в растениях в форме провитамина - каротина, наиболее активным среди которых является бета-каротин.

Нормальная концентрация в сыворотке - 1,05-2,27 мкМ/л или 300-650 мкг/л.

Недостаточность витамина А, которая может возникать не только при дефиците ретинола или каротина в пище, но и из-за нарушения их всасывания при заболеваниях кишечника, а также при малом количестве жира и белка в пище, способствует усилению ПОЛ. В большей степени страдает эпителий различных органов и глаза (замедление восстановления зрительного пурпура - родопсина). Это проявляется повышенной восприимчивостью к бронхолегочным заболеваниям, инфекциям мочевыводящих путей, слизистой оболочки глаз, кожи, снижением остроты зрения в темноте («куриная слепота»).

Витамин Е (токоферолы) - группа веществ, среди которых наибольшей активностью обладает альфа-токоферол. Жирорастворимый витамин, действует сопряженно с витамином А. В сыворотке крови и клетках основная часть связана с липопротеидами.

Определение уровня альфа-токоферола в плазме крови.

Принцип метода: Альфа-токоферол плазмы экстрагируют смесью «этанол-гексан». Отобранную гексановую фазу выпаривают. К полученному остатку добавляют хлорное железо, способное восстанавливаться из трехвалентного состояния в двухвалентное под действием антиоксидантов (и прежде всего альфа-токоферола). О количестве альфа-токоферола судят по содержанию восстановленного железа, которое определяют реакцией с альфа-2-,альфа-2-дипиридилом, сопровождающейся образованием комплекса красного цвета.

Нормальная концентрация в сыворотке крови - 5-20 мг/л.

Степень обеспеченности организма витамином Е можно характеризовать путем непосредственного определения его концентрации в крови, и косвенным методом, определяя перекисную резистентность эритроцитов .

Перекисная резистентность эритроцитов (ПРЭ) - показатель обеспеченности мембран антиоксидантами, в первую очередь витамином Е, и их устойчивости к повреждающему действию перекисей.

Нормальная величина - до 10%.

Увеличение свидетельствует о недостаточной антиоксидантной защите клеточных мембран, высокой подверженности ПОЛ и лабильности. Имеются сезонные колебания ПРЭ с повышением процента перекисного гемолиза в весенний период. .

Витамин С (аскорбиновая кислота) - водорастворимый витамин, который, в отличие от животных, в организме человека не синтезируется и поступает только с пищей. Предотвращает окисление витаминов А и Е, восстанавливает окисленные формы ферментов и различных субстратов участвует в большом количестве обменных реакций. Регулирует проницаемость сосудистой стенки, существенно усиливает устойчивость организма к инфекциям, необходим при образовании коллагена, заживлении ран и ожогов.

Нормальная концентрация:

в крови -6-20 мг/л,

в моче -20-30 мг/сутки.

Суточная потребность - 45-60 мг; существенно возрастает при физической и нервно-психической нагрузке, низкой и высокой температуре, облучении, курении (1 сигарета разрушает 25 мг витамина С), беременности и кормлении, хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта, приеме антибиотиков и сульфаниламидов. Аскорбиновую кислоту не рекомендуется принимать онкологическим больным в период лучевой и химиотерапии.

Недостаточность витамина С в пище способствует усилению ПОЛ, нарушениям обмена многих веществ, функций нервной и эндокринной систем, снижению устойчивости к инфекциям и проявляется слабостью, повышенной утомляемостью, раздражительностью, болями в конечностях и другими неспецифическими симптомами. Длительный авитаминоз вызывает развитие цинги.

Антиоксидантные ферменты.

Супероксиддисмутаза (СОД) - фермент, катализирующий реакцию нейтрализации супероксидного радикала О2. Является основным ферментом внутриклеточной антирадикальной защиты. Нормальная активность в эритроцитах (метод восстановления НСТ) - 1,04 ± 0,05 усл. ед./мг гемоглобина. Абсолютные величины колеблются в зависимости от используемых реактивов. Наиболее доступной для анализа является эритроцитарная СОД, содержащая CuZn.

Определение активности эритроцитарной СОД методом R. Fried. Принцип метода: метод основан на определении степени ингибирования под действием эритроцитарной СОД реакции восстановления нитросинего тетразолия супероксидными радикалами.

Исследование активности СОД выполняют при комнатной температуре. Кровь должна быть взята с гепарином. Фермент может оставаться стабильным до 1 недели при хранении при температуре +4 С.

Активность фермента выражают в условных единицах (усл. Ед.). 50% ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия по сравнению с контрольной пробой принято считать 1 усл. ед.

Нормативные величины:1,04±0,3/мг гемоглобина.

В начальный период усиленного образования свободных радикалов происходит повышение активности СОД для их нейтрализации. Если процесс радикалообразования продолжает усиливаться, то на определенном этапе происходит истощение компенсаторных резервов и активность СОД снижается ниже нормы, что свидетельствует о декомпенсации данного защитного механизма.

Увеличение активности СОД наблюдается при отравлениях гашишем, четырёххлористым углеродом, амитриптилином, фосфорорганическими соединениями, уксусной кислотой, при септицемии, очаговом туберкулёзе, лейкозах, мышечной дистрофии Дюшена, муковисцидозе, талассемии, инфаркте миокарда, при психических заболеваниях.

Увеличение активности СОД без соответствующей активации или отсутствии других антиоксидантных ферментов - каталазы (гипо-, акаталаземия), пероксидаз является неблагоприятным изменением для организма из-за накопления перекиси водорода - продукта супероксиддисмутазной реакции.

Снижение активности СОД наблюдается при отравлении окисью углерода, соединениями свинца, кадмия, при септикопиемии, при ИБС, атеросклерозе сосудов головного мозга, при эпилепсии, у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, с ретинопатиями, у беременных с поздним токсикозом (диагностический тест для определения внутриутробной гипоксии плода). Низкие показатели активности фермента следует рассматривать как неблагоприятный прогностический признак, указывающий на снижение неспецифической резистентности организма.

Проводить определение активности СОД целесообразно с одновременным исследованием других компонентов АОЗ и показателей ПОЛ.

Каталаза - фермент, осуществляющий разложение перекиси водорода до кислорода и воды. Максимальное количество содержится в эритроцитах. Обладает специфической антиоксидантной защитной функцией в отношении эндотелиальных клеток.

Нормальная активность - 18,4 - 25,0 мкЕД/эритроцит.

В начальную компенсаторную фазу радикалообразования происходит повышение активности фермента, в фазу декомпенсации - снижение. С возрастом активность фермента падает.

Определение активности каталазы методом E. Beutler.

Принцип метода: метод основан на определении скорости разложения перекиси водорода в мМ/мин спектрофотометрически при длинне волны 230. Для стабилизации гемолизата и разложения комплекса каталаза - перекись водорода добавляют этанол.

Определения активности каталазы крови по методу Баха и Зубковой.

Принцип метода: метод основан на определении количества перекиси водорода, которое разрушается ферментом за 30 минут. В опыте определяют количество неразрушенной перекиси водорода в ходе каталазной реакции, в контроле количество перекиси,взятой в пробу с ферментом, инактивированным кипячением. Перекись водорода оттитровывают пермаганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:

2KMnO + 5H2O2 + 4 H2 SO + 2 KMnSO + 8H2O +5O2

Разность между цифрами титрования контроля и опыта соответствует количеству разрушенной перекиси водорода под действием каталазы.

Нормативные величины:

Метод титрометрии: каталазное число 12-20. В одном мкл. Крови у мужчин содержится 4·10- 5·10 эритроцитов, у женщин 3,9·10 - 4,7·10 эритроцитов.

Метод фотометрии: по E. Beutler 15,31·10 ± 2,39·10 МЕ/г гемеглобина.

Увеличение активности каталазы наблюдается при гемолитических состояниях, при хирургических вмешательствах проводимых под местной анестезией, у детей с бронхолёгочной патологией, ревматойдным артритом, тиреотоксическим зобом.

Снижение активности каталазы наблюдается при инфекционных заболеваниях, железодефицитной анемии, синдроме мальабсорбции, карциноме, у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, хронических отравлениях фосфором, мышьяком, свинцом, ртутью, общем наркозе, назначении антибиотиков. Определение активности каталазы целесообразно проводить с одновременным исследованием активности других АО-ферментов, содержания метгемоглобина и продуктов ПОЛ.

Наиболее распространенным методом определения активности ГР является спектрофотометрический метод. Среди других методов следует отметить колориметрическое определение активности ГР по скорости образования восстановленного глутатиона при йодометрическом титровании или с помощью цветной реакции с нитропрусидом.

Определение активности ГР методом Бойтлера.

Принцип метода: метод основан на спектрофотометрическом определении количества израсходованного в ходе ферментативной реакции кофермента НАДФН, учитываемого по изменению поглощения при 340 нм. Длинна волны 340 нм соответствует максимуму поглощения восстановленного кофермента. В ходе реакции по мере окисления НАДФН оптическая плотность инкубационной пробы снижается.

Активность ГР значительно повышается в сыворотке больных саркомой, у больных карциномой молочной железы и при других неопластических заболеваниях. Увеличение ГР наблюдается при гепатитах, механической желтухе и реже - при циррозе. Высокие значения активности могут определяться при остром инфаркте миокарда. Как правило, мегалобластическая анемия сопровождается повышением уровня активности ГР.

Глутатионпероксидаза (ГП). Катализирует реакцию окисления глутатиона Г- SH перекисью водорода (1-я реакция) или гидроперекисями ROOH (2-я реакция), образующийся в результате ПОЛ.

Вклад ГП в обезвреживание перекиси водорода по сравнению с каталазой более значителен. Она имеет большее сродство к перекиси водорода и разлагает ее даже при небольших концентрациях. В активном центре фермента находится селен. На 1 моль фермента приходится 4 грамма атома селена.

Определение активности ГП методом E. Beutler.

Принцип метода: метод основан на определении скорости образования окисленного глутатиона, содержание которого определяется в сопряженной глутатионредуктазной реакции по степени окисления НАДФН при 340нм.

Г - S - S - Г + НАДФН→2Г - SH + НАДФ

В качестве гидроперекиси используют t-бутил гидропероксид.

Нормативные величины: По Beutler 30,8± 4,73 МЕ/г гемоглобина (при заборе крови с ЭДТА) и 34,2±3,84 МЕ/г гемоглобина (в гепаринизированной крови). По Тицу: 19,9±0,31 МЕ/моль гемоглобина и 0,89±0,14 НЕД/эритроцит.

Увеличение активности наблюдается при дефиците глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, α-талассемии, остром лимфоцитарном лейкозе.

Снижение активности ГП наблюдается при железодефицитной анемии, отравлении свинцом, серповидноклеточний анемии, дефиците селена.

Церулоплазмин (медная оксидаза). Медьсодержащий гликопротеид α2-глобулиновой фракции. Функции цирулоплазмина разнообразны: это основная оксидаза плазмы крови, реактант острой фазы, осуществляет транспорт Cu для синтеза СОД и цитохромоксидазы. Цирулоплазмин проявляет свои АО свойства экстрацеллюлярно без образования каких бы то ни было радикалов.

Чистый белок церулоплазмина имеет интенсивную голубую окраску.

Простой колориметрический метод, который предложил Ravin, широко используется в модификации (С.В. Бестужевой и В.Г. Колба).

Существуют и другие методы исследования: нефелометрический, манометрический и иммунологический. При манометрическом методе реакция проходит в аппарате Варбурга, измеряют скорость потребления кислорода (мкмоль потребленного кислорода за 1 мин на 1 литр сыворотки в определённых условиях). Отмечена превосходная корреляция между значениями, полученными колориметрическим методом Ревина и монометрическим. Колориметрический метод модифицирован для использования в автоанализаторе.

Определение активности цирулоплазмина модифицированным методом Ревина.

Принцип метода: метод основан не ферментном окислении n-фенилендиамина церулоплазмином. Реакция останавливается добавлением фтористого Nа. По оптической плотности образующихся окрашенных продуктов судят о концентрации церулоплазмина.

Уровень церулоплазмина в сыворотке увеличевается при различных инфекционных заболеваниях, при остром и хроническом воспалительных процессах, сопровождающихся деструктивными и некротическими изменениями в тканях, при злокачественном росте и шизофрении.

Антиоксидантная активность (АОА) - комплекс ферментативных и неферментативных реакций связывания и разложения промежуточных продуктов пероксидации, тормозящих свободно-радикальное окисление липидов. Определяется чаще всего методом хемилюминисценции в модельных системах.

Нормальная величина для сыворотки крови - 60-75%.

Высокий уровень АОА обеспечивает устойчивость к перекисным повреждениям клеточных мембран и низкий уровень ПОЛ.

Низкий уровень АОА способствует усилению ПОЛ, торможению процессов пролиферации и регенерации.

Клиническое значение определения АОА состоит в той, что одни патологические процессы развиваются на фоне повышенной АОА, а другие - на фоне сниженной АОА и поэтому требуют разнонаправленной коррекции. .

Заключение

Таким образом, в основе сохранения свободнорадикального гомеостаза лежит баланс между прооксидантными и антиоксидантными процессами, поддерживающими перекисное окисление в пределах, не только совместимых с жизнью, но и полезных для нее. Нарушение этого баланса является отправной точкой в инициации «свободнорадикальной патологии». Срыв антиоксидантной защиты характеризуется развитием свободнорадикальных повреждений разных компонентов клеток и тканей. Все клеточные компоненты в той или иной степени подвержены перекисному окислению, но наиболее выражен этот процесс в липидных (фосфолипидных) структурах, прежде всего в липидном бислое мембран. Нарушение про-, антиоксидантного равновесия, сопровождающееся увеличением концентрации продуктов ПОЛ в тканях и жидкостях организма, отмечено при самых различных заболеваниях: воспалительных, сердечнососудистых, онкологических, инфекционных, ожоговой и лучевой болезни, при разнообразных токсических воздействиях, а также при старении организма. Все это позволяет исследователям рассматривать активацию ПОЛ как универсальный компонент неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия, т.е. как звено стресс-реакции.

Из изложенного выше следует, что механизм поддержания прооксидантно-антиоксидантного равновесия достаточно сложен. С одной стороны, действуют окислительные и проокислительные факторы и субстраты: молекулярный кислород, ОН˙, гидроперекиси, органические перекиси, эпоксиды, легко-окисляющиеся субстраты (липиды), окислительные ферменты и свободные ионы металлов с переменной валентностью, нейромедиаторы (катехоламины). С другой, - антиоксидантные компоненты; ферменты (СОД, ГПО, глутатионтрансфераза, каталаза), гормоны (стероидные и тиреоидные), биоамины (серотонин, гистамин), жирорастворимые антиоксиданты - компоненты мембран (токоферолы, убихиноны, ретиноиды, каротиноиды, фенольные соединения); водорастворимые антиоксиданты (тиоловые соединения, аскорбат, водорастворимые фенолы); ионы селена - свободные и в составе антиоксидантных ферментов.

Список использованных источников

Дубинина, Е. Е. Окислительный стресс как реакция адаптации организма к экстремальным условиям / Е. Е. Дубинина //Вопросы медицинской химии. - 2001. - № 6., том 47 - С. 561-581.

Балаболкин, М. И. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений диабета / М. И. Балаболкин, Е. М. Клебанова // Проблемы эндокринологии. - 2000. - № 6. - С. 29-34.

Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в главных системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова; под ред. А.И. Деев. - М.: ВИНИТИ, серия биофизика, 1991. - 252 с.

Свободные радикалы. Определение, номенклатура, классификация [Электронный ресурс] / академик РАМН, профессор Владимиров Ю.А. - 2006. - Режим доступа: #"justify">Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Медицина, 1972. - 252 с.

Шанин, Ю.Н. Антиоксидантная терапия в клинической практике / Ю.Н. Шанин, В. Ю Шанин, Е. В.Зиновьев. - Санкт - Петербург, ЭЛБИ - СПб., 2003 - 128 с.

Зайчик, А.Ш. Общая патофизиология (с основами иммунологии) / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурило. - Санкт - Петербург, ЭЛБИ - СПб., 2005. - 656 с.

Кашулина, А. П. Роль перекисного свободнорадикального окисления в патологии и методы его изучения / А. П. Кашулина, Е. Н. Сотникова // Мед. консультирование. - 1996. - № 2. - С. 20-24.

Буеверов, А. О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени / А. О. Буеверов. // Российский журнал гастроэнторологии. - 2002. - № 4. - С. 21-25.

Хуцишвили, М. Б. Свободнорадикальные прцессы и их роль в патогенезе некоторых заболеваний / М. Б. Хуцишвили, С. И. Рапопорт. // Клиническая медицина. - 2002. - № 10. - С. 10-16.

Troy, C.M. Down-regulation of copper zinc superoxide dismutase causes apoptotic death in PC 12 neuronal cells / C.M. Troy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - № 14. - P. 6384 - 6387.

Болдырев, А. А. Введение в биомембранологию: учеб. пособие / Под ред. А. А. Болдырева. - М.: Изд-во МГУ, 1997. - 208 с.

Повреждение компонентов биологических мембран при патологических процессах [Электронный ресурс] / М.: - 2006. - Режим доступа: #"justify">Radi, R. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide / R. Radi // Arch. Biochem. Biophys. - 1991. - №2. - P. 481-487.

Даниловой, Л. А. Сборник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л. А. Даниловой. - СПб.: Питер, 2003. - 736 с.

Лифшиц, В.М. В. И. Сидельникова. ″Медицинские лабораторные анализы″. Справочник. Издание второе исправленное и дополненное / В.М. Лифшиц, В. И. Сидельникова.- М.: ″Триада - Х″, 2003. - 312 с.

Николаев, А. Я. Биологическая химия / Николаев А. Я. - М.: Медицинское информационное агенство, 2001. - 496 с.

Читайте также

Количественное определение малонового диальдегида в ткани печени.

Выводы

Список использованной литературы

ПЕРЕКИСНЕ ОКИСнЕННЯ ЛІПІДІВ: ПРОТИРІЧЧЯ ПРОБЛЕМИ

LIPID PEROXIDATION: CONTROVERSERY PROBLEM

Похожие работы на - Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов